鋅指蛋白ZBTB20基因重組腺病毒表達載體的構建和鑒定*

朱曉彤， 楊 瑞， 周露婷， 張 曄， 李 玲， 章衛平， 施廣霞， 陳玉霞△

(1第二軍醫大學基礎部病理生理學教研室, 上海 200433； 2大連醫科大學病理生理學教研室，遼寧 大連 116044)

鋅指蛋白是一類含有鋅指結構的DNA結合蛋白，可以正向或者負向地調控基因的轉錄活性，在個體發育、定向分化、細胞增殖、凋亡和功能調節等生命過程中發揮重要作用。含鋅指和BTB區蛋白20(zinc finger and BTB domain containing 20, ZBTB20)由741個編碼氨基酸組成，N端含有POZ結構域(通常介導蛋白間的相互作用)，C端含有5個C2H2鋅指結構域(通常介導DNA 的結合)，與已知的POZ鋅指蛋白B細胞淋巴瘤6(B-cell lymphoma 6，BCL6)和前髓細胞性白血病鋅指蛋白(promyelocytic leukaemia zinc finger protein, PLZF) 有30%～40%的同源性[1]。利用ZBTB20基因特異性敲除小鼠模型，本實驗室揭示了ZBTB20在個體發育、物質代謝和神經調控等方面有重要的生理功能[2-7]。盡管如此，目前國際上對其生物學功能的認識仍然非常有限。本研究擬構建ZBTB20的重組腺病毒表達載體，并驗證該重組腺病毒在原代肝細胞和小鼠肝臟組織中介導的ZBTB20過表達情況及功能活性，為進一步研究ZBTB20在肝臟的生物學功能奠定基礎。

材 料 和 方 法

1 材料和試劑

人ZBTB20表達載體pBFN-ZBTB20-FLAG為本實驗室所存，pAdEasy-1/BJ5183菌為本實驗室自行制備；感受態大腸桿菌DH-5α購自Stratagene；高糖DMEM細胞培養基、胎牛血清、生理鹽水購自HyClone；轉染試劑Lipofectamine 2000 購自Gibco-BRL；限制性內切酶購自New England Biolabs；T4連接酶購自TaKaRa；小量質粒抽提試劑盒購自Omega；DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen；雙螢光素酶檢測試劑盒購自Promega；ZBTB20抗體為本實驗室自行制備;FLAG抗體M2購自Sigma;β-tubulin抗體購自Proteintech；HRP標記的羊抗兔與羊抗小鼠II抗購自Cell Signaling。

2 方法

2.1pAd-ZBTB20重組腺病毒載體的構建與鑒定BglⅡ/NotⅠ雙酶切含FLAG標簽的人ZBTB20(short isoform)表達質粒pBFN-ZBTB20-FLAG，回收ZBTB20-FLAG的 cDNA片段(約2.2 kb)，克隆至穿梭質粒pAdTrack-CMV[約9.2 kb，攜帶有綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因序列]，得到重組的穿梭載體pAdTrack-ZBTB20。將重組的穿梭載體經PmeⅠ酶切線性化后，利用電轉化法將其轉化到預轉化有pAdEasy-1的感受態細菌BJ5183中進行同源重組，并在卡那霉素抗性的培養基上進行篩選，挑取單克隆，利用PacⅠ酶切鑒定后，最終得到重組成功的腺病毒載體pAd-ZBTB20；將其轉化至DH-5α感受態細菌中，純化制備質粒DNA。

2.2重組腺病毒Ad-ZBTB20的包裝、擴增、純化及滴度測定 包裝和擴增：利用Effectene轉染試劑將2 μgPacⅠ酶切線性化的pAd-ZBTB20質粒轉染293細胞，轉染10～14 d后觀察到部分細胞出現細胞病變反應(cytopathic effect, CPE)。待細胞完全被病毒感染后，收集細胞，于干冰和37 ℃水浴反復凍融并劇烈振蕩細胞3次，釋放出腺病毒。將收集到的病毒液重復感染293細胞3次，最后一次細胞培養規模為3×108，使腺病毒進一步擴增，從而得到更高滴度的腺病毒Ad-ZBTB20。 純化：將最后收集到的病毒液轉移至12 mL離心管中，加入適量的CsCl，調整密度至(1.32～1.35)×103g/L之間，封以液體石蠟，于10 ℃、176 000×g離心20 h。穿刺收集濃縮的病毒條帶，轉移入透析袋(截留分子量為10 kD)，浸入200倍于病毒液體積的透析液中(透析液配方：4%蔗糖，10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，2 mmol/L MgCl2)，4 ℃透析過夜去鹽后分裝保存于-80 ℃。滴度測定：因重組腺病毒載體帶有GFP基因，感染細胞后能同時分別表達GFP和ZBTB20，故而我們采用流式細胞術檢測病毒滴度：接種細胞于12孔板，密度為4×105。次日加入倍比稀釋后的含重組腺病毒Ad-ZBTB20的培養液，孵育24 h后消化收集細胞，調整細胞懸液體積為1 mL，計數板計細胞數，取200 μL上機檢測GFP陽性的細胞比例，據如下公式計算病毒滴度[GFU(green fluorescent unit)/mL]=GFP陽性細胞比例×每孔細胞數/培養液體積(mL)×病毒稀釋度[8]。

2.3重組腺病毒感染的離體細胞模型與在體小鼠模型的建立 離體細胞模型：采用本室建立的兩步原位膠原酶灌注法分離肝臟組織特異性ZBTB20基因敲除小鼠的原代肝細胞[9]，接種于6孔板中進行培養。待肝細胞貼壁后，用PBS清洗2遍，分別加入含有腺病毒Ad-ZBTB20和對照腺病毒Ad-GFP的無血清培養基, 病毒感染復數(multiplicity of infection, MOI)=5～10，孵育12 h后更換以含10% FBS的新鮮培養基繼續培養48 h，用于后續實驗。小鼠在體模型：取肝臟組織特異性ZBTB20基因敲除的同窩小鼠，經尾靜脈分別緩慢注射重組腺病毒Ad-ZBTB20和對照病毒Ad-GFP 各5×109(用PBS調整至總體積200 μL)，常規飼養3 d后，經4%水合氯醛溶液麻醉放血后取肝臟組織，迅速凍存于液氮。

2.4蛋白表達的檢測(Western blotting法) 稱量50 mg液氮凍存的肝臟組織，加入0.5 mL RIPA蛋白裂解液，冰上勻漿后常規制備蛋白樣品。蛋白樣品經Bradford法定量后取20 μg跑8% SDS-PAGE，轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉后先后與小鼠抗ZBTB20單克隆抗體9A10[3](1∶1 000)或小鼠抗FLAG抗體M2(1∶1 000)、兔抗小鼠IgG Ⅱ抗(1∶10 000)雜交，ECL法顯影檢測ZBTB20或FLAG蛋白的含量。再經0.2 mol/L NaOH洗膜去除前述抗體后再先后與兔抗小鼠β-tubulin特異性抗體(1∶10 000，作為內參照)、山羊抗兔IgG Ⅱ抗(1∶10 000)雜交，ECL法顯影檢測β-tubulin蛋白的含量。

2.5甲胎蛋白-螢光素酶報告基因(alpha fetoprotein-luciferase reporter, AFP-luc)活性的檢測 分離ZBTB20肝臟特異性敲除小鼠的原代肝細胞，以每孔1.5×105的密度接種于24孔板。待細胞貼壁后，加入重組腺病毒Ad-ZBTB20或Ad-GFP(MOI=1～100)孵育過夜。更換新鮮培養液4 h后，用脂質體Lipofectamine 2000試劑轉染含AFP啟動子序列的螢光素酶報告基因質粒(pAFP-luc)[4]200 ng和內參照質粒(pRLSV40-Luc)10 ng，轉染12 h后更換以新鮮培養液繼續培養48 h，裂解細胞，檢測螢光素酶的活性。實驗重復3次 。

3 統計學處理

數據用均數±標準差(mean±SD)表示，采用t檢驗比較各組間螢光素酶活性的差異。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 重組腺病毒載體pAd-ZBTB20的構建和鑒定

BglⅡ/NotⅠ雙酶切鑒定得到的重組穿梭質粒pAdTrack-ZBTB20，可見約9.2 kb和2.2 kb片段，提示重組穿梭載體構建成功，見圖1A。PmeI線性化的重組穿梭載體pAdTrack-ZBTB20與腺病毒骨架質粒 pAdEasy-1在BJ5183細菌中同源重組，將得到的重組腺病毒質粒pAd-ZBTB20經PacⅠ酶切鑒定，可見約30 kb和3 kb大小的2個片段，提示成功同源重組，見圖1B。

2 重組腺病毒載體Ad-ZBTB20的包裝及滴度測定

用Effectene轉染試劑將線性化后的pAd-ZBTB20轉染293細胞，轉染48 h時可見散在綠色熒光，至第13天，可見明顯的細胞毒效應，大多數細胞變圓漂起(圖2A)，并且所有細胞均有綠色熒光(圖2B)。收集細胞，經干冰和37 ℃水浴反復凍融并劇烈振蕩3次，收集含病毒的細胞裂解液上清，流式細胞術檢測此病毒滴度為9.1×1010/L。反復感染3次，收獲病毒總量為6.87×1011。氯化銫超速離心后可見白堊色病毒條帶，穿刺抽吸出病毒條帶并透析去鹽后，用流式細胞術測得滴度為5.7×1013/L。

Figure 1. Identification of the recombinant vectors by the restrictive endonucleases.A: recombinant shuttle vector digested by Bgl Ⅱ/NotⅠ； 1： pAdTrack-ZBTB20;B: recombinant adenovirus vector digested by PacⅠ; 1：pAd-ZBTB20.

3 重組腺病毒Ad-ZBTB20的表達檢測

感染對照腺病毒的細胞未檢測到ZBTB20蛋白(這與ZBTB20基因特異性敲除的表型相一致)，而感染重組腺病毒Ad-ZBTB20的細胞表達有高豐度的ZBTB20蛋白，其表達水平隨著MOI值的增加而增高。我們以ZBTB20基因所攜帶的FLAG標簽蛋白為檢測對象，也得到了同樣的結果,見圖3。這提示我們所構建的重組腺病毒在離體培養的細胞中能成功表達目標蛋白ZBTB20。重組腺病毒Ad-ZBTB20在小鼠肝臟組織也能成功表達ZBTB20蛋白，見圖4。

Figure 3. Adenovirus-mediated ZBTB20 protein overexpression in the primary hepatocytes from the liver-specific ZBTB20 knockout mice.

Figure 4. Adenovirus-mediated ZBTB20 protein overexpression in the hepatic tissue of liver-specific ZBTB20 knockout mice.

4 重組腺病毒Ad-ZBTB20介導表達的ZBTB20蛋白功能活性的分析

在原代肝細胞模型，重組腺病毒Ad-ZBTB20顯著抑制AFP-luc的活性；當MOI值為1、10和100時，抑制率分別為26.7%、90.9%和79.4%,見圖5。

討 論

新型鋅指蛋白ZBTB20是首先從人樹突狀細胞中克隆并率先報道的含BTB/POZ結構域的鋅指蛋白家族新成員。利用ZBTB20全身和組織特異性敲除小鼠模型，我們實驗室近年來的研究表明ZBTB20參與了機體多種組織器官的發育、糖脂等物質代謝、學習記憶能力的調節以及腫瘤發生發展等過程的調節[2-7]。

Figure 5. Inhibitory effect of adenovirus-mediated overexpression of ZBTB20 protein on AFP gene transcription in the primary hepatocytes. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs Ad-GFP group at the same MOI.

ZBTB20基因敲除小鼠表現為出生后生長發育遲緩、生殖能力降低、死亡率升高、低血糖、能量貯備能力降低、多種代謝相關激素水平異常(如胰高血糖素水平升高，胰島素水平降低，抵抗素水平升高等)；此外，還存在海馬、垂體發育異常等表型[2-3]。利用海馬成熟的CA1區特異性ZBTB20敲除小鼠模型，我們發現ZBTB20缺失導致長期學習能力和記憶力降低，N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)受體介導的興奮性突觸后電流減弱，同時存在細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)和cAMP 反應元件結合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB)磷酸化水平降低。這提示ZBTB20參與學習記憶能力的形成[5]。此外，利用ZBTB20肝臟特異性基因敲除小鼠模型，本實驗室的研究發現ZBTB20是胚胎出生后關閉肝臟AFP轉錄表達的關鍵轉錄抑制因子[4]。另外，ZBTB20還是肝癌預后的一個獨立預警因素：與正常肝臟組織和癌旁組織相比，肝癌組織中ZBTB20 mRNA 和蛋白表達水平明顯增加，并且與靜脈侵襲、復發、轉移的發生率密切相關。高表達ZBTB20蛋白的肝癌患者無瘤生存期和總存活期明顯較低表達者為低[10]。而且，ZBTB20近來也被發現是漢族人患非賁門胃癌的易感基因[11]。這些均提示新型轉錄因子ZBTB20在細胞惡變過程中也發揮著積極的作用。盡管這樣，關于ZBTB20的生物學功能、其調控的下游靶基因以及介導的信號轉導通路仍有許多未明之處。

AdEasy腺病毒過表達系統是目前應用最為廣泛的病毒表達載體，其原理是通過同源臂重組的方式在細菌中獲得重組腺病毒基因組質粒，將克隆了外源基因的腺病毒穿梭質粒(pAdTrack-CMV)與攜帶了腺病毒大部分基因組的質粒(pAdEasy) 共轉化RecA+細菌，在細菌RecA重組酶的作用下經抗性篩選獲得重組腺病毒基因組質粒，將其線性化后轉染293細胞獲得重組腺病毒。重組腺病毒是非整合型雙鏈DNA病毒，因而無插入突變，無致癌性。它具有轉染分裂期和非分裂期細胞的能力，且易于構建、濃縮和純化，出毒率較高。重組腺病毒通過腹腔或尾靜脈注射后具有肝臟組織聚集性，因而成為研究肝臟生物學的重要病毒載體[12]。我們前期的研究提示ZBTB20在肝臟物質代謝、肝癌的發展中具有重要作用，因此具有肝臟靶向性的腺病毒表達載體無疑是我們進一步研究ZBTB20在肝臟的生物學功能及其作用機制的首選工具。

我們利用AdEasy系統構建了ZBTB20的重組腺病毒表達載體，該重組腺病毒感染離體細胞或在體注射后均能成功過表達ZBTB20蛋白。ZBTB20作為一種轉錄因子，其功能活性表現在調節下游靶基因的轉錄。我們前期的研究表明AFP是ZBTB20的靶基因之一，ZBTB20能特異性抑制AFP基因的轉錄。利用報告基因技術，我們進一步證明重組腺病毒介導過表達的ZBTB20蛋白能夠顯著抑制AFP基因的轉錄，提示所構建的重組腺病毒能夠成功表達有功能活性的ZBTB20蛋白，為深入研究ZBTB20在肝臟的生理病理學作用及其作用靶點提供了有效的工具。另外，我們還在ZBTB20蛋白C末端連上了FLAG標簽，這為將來通過免疫共沉淀方法富集、純化ZBTB20的共作用蛋白提供了便利。

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