中樞神經系統CRTC1的研究進展*

黃 蒙， 張俊芳， 王欽文， 陳慧敏

(1寧波大學醫學院生理學與藥理學系， 2寧波市第二醫院神經內科，浙江 寧波 315211)

在中樞神經系統中，突觸可塑性作為學習記憶的主要表現形式，需要多種信號通路的參與，以及新蛋白質合成。轉錄因子cAMP反應元件結合蛋白(cAMP response element-binding protein，CREB)依賴的轉錄調控在突觸可塑性的維持過程中發揮重要作用，有助于短時程記憶向長時程記憶轉換[1-7]。CREB依賴的轉錄取決于多種細胞機制，包括CREB第133位絲氨酸(Ser133)磷酸化、CREB結合蛋白(CREB-binding protein，CBP)等特異性調節因子的參與。以往研究認為，神經元活性升高增加轉錄因子CREB的磷酸化水平，在CBP的協同作用下介導含cAMP反應元件(cAMP response element，CRE)序列基因的表達[8]。但有研究報道，CREB的磷酸化水平與CRE靶基因表達水平不一致[9-10]。近年來，在成年大鼠腦內新發現一類CREB調控的轉錄共激活因子(CREB-regulated transcription coactivators，CRTCs)。CRTCs作為CREB的調節因子，不需磷酸化CREB Ser133就能促使靶基因的轉錄[11]。研究報道CRTC1活動依賴性的細胞核聚集是海馬長時程增強(long-term potentiation，LTP)維持的必需過程[12]。本文針對CRTC1的發現、調控相關分子機制、在突觸可塑性中的作用以及和神經系統相關疾病的研究做一綜述。

1 CRTC1概況

1.1CRTC1的發現 CRTCs是一個主要調節CREB轉錄因子活性的蛋白質家族，2003年首先由諾華制藥公司的科研人員利用基因組高通量篩選發現。CRTCs首次發現時被命名為TORC(transducer of regulated CREB)[11]，為了與哺乳動物雷帕霉素靶點mTORC(mammalian target of rapamycin)名稱相區別，NCBI重新命名為CRTCs。功能性CRTCs基因被證實存在于果蠅、鼠類及人類中。哺乳動物的CRTCs家族有3個成員，即CRTC1、CRTC2和CRTC3。3種亞型在N端同源性高，其高度保守的卷曲螺旋結構域(coiled-coil domain)能與CREB的堿性亮氨酸拉鏈結構域(basic leucine zipper，bZIP)相結合，提示其對CREB依賴的轉錄調控可能具有重要作用[13]。

1.2CRTC1的分布 研究發現CRTC1在腦組織中高表達，主要分布在海馬和大腦皮層[12,14]。在海馬神經元中主要表達于細胞質和樹突結構中，在膠質細胞和中間神經元中都不表達[15-16]。CRTC2和CRTC3普遍表達于多種組織中。CRTC2主要分布在肌肉組織，在部分腦區也少量表達，目前已經證實CRTC2主要與高血糖、胰島素耐受及血脂功能紊亂相關。CRTC3則主要分布在淋巴細胞和肺組織中，在中樞神經系統中表達很低，目前研究較少。因此，CRTC1與中樞神經系統的功能有著密切的關系。另外，序列分析顯示CRTC1基因主要存在于鼠類和人類中，在鼠類CRTC1基因包括1 893個堿基對組成的開放閱讀框，能夠編碼630個氨基酸殘基，CRTC1在鼠類和人類中核酸水平有88%的同一性[12]。

1.3CRTC1活化、調控的分子機制 研究發現，CRTC1在神經元中的分布與活性受神經元活動影響。CRTC1通過其第177位絲氨酸(Ser177)磷酸化，以非活性的狀態儲存在細胞質中，并且與14-3-3蛋白結合以維持其Ser177磷酸化狀態[17]。神經元中CRTC1是感受胞漿Ca2+和cAMP信號的傳感器，以PP2B/calcineurin依賴性的去磷酸化方式活化后，傳遞突觸活動信號到細胞核介導CRE靶基因轉錄。CRTC1在核內聚集促進CRE靶基因的表達，如bdnf、c-fos、nr4a2等，其中也包括sik1。隨著神經元的繼續去極化，SIK1反過來促進CRTC1磷酸化，隨后使核內CRTC1減少。這提示SIK1參與了CRTC1的出核過程，在長時程神經活動過程中可能作為一個負反饋信號阻止CREB/CRTC1依賴性轉錄的持續激活[18]。在無谷氨酸存在或有NMDA受體拮抗劑存在時，CRTC1的核內轉移過程會被阻斷，提示NMDA受體的激活在誘導CRTC1向細胞核轉移過程中起到重要作用[19]。另有研究報道，視網膜神經節細胞過表達NMDA受體，也會促進CRTC1向核內聚集[20]。其機制可能是NMDA受體被激活后，可進一步激活calcineurin促進CRTC1去磷酸化，進而向細胞核內轉移。另外，CRTC1不僅是CREB調控轉錄的必需共激活因子，而且研究發現CRTC1能夠與轉錄因子同源異型盒蛋白MEIS1A(homeobox protein MEIS1A)結合，調控Hoxb2和Meis1的轉錄，主要在胚胎形成、白血病及不安腿綜合征中發揮著重要作用[21]。CRTC1還可能與轉錄因子人T淋巴細胞1型病毒(human T-cell lymphotropic virus type 1，HTLV-1)Tax蛋白和轉錄因子激活蛋白1(activator protein-1，AP-1)結合，進而調節相關基因的表達，促進細胞增殖及白血病形成[22-23]。

2 CRTC1在cAMP-PKA-CREB通路中的作用及機制

CREB是bZIP蛋白家族成員之一，是一種位于細胞核內的轉錄因子，分子量為43 kD，能夠與DNA調控序列CRE結合，進而調節CREB依賴的靶基因表達[24]。利用RNAi沉默CRTC1 能抑制神經元活動引起的CRE靶基因轉錄，過表達CRTC1本身可以增強 CRE 靶基因轉錄，證明CRTC1激活是神經元活動依賴的CRE 靶基因轉錄的充要條件[25]。一方面，當細胞受到外來信號刺激，激活胞內鈣調蛋白(calmodulin，CaM)Ⅱ/Ⅳ、蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、CREB-1和CREB-2信號通路，通過CREB Ser133磷酸化途徑使激酶誘導結構域(kinase inducible domain，KD)與CBP KIX結構域相互作用激活靶基因轉錄[26]；另一方面，當Ca2+和cAMP濃度變化時，細胞質內CRTC1去磷酸化活化并轉移至細胞核內，通過其N端螺旋狀結構域與CREB bZIP結構域結合，通過非磷酸化途徑激活CRE靶基因轉錄[13,25]。

CRTC1可能通過增強CREB與RNA聚合酶起始復合物相互作用，或者增加CREB對某些啟動子的DNA結合位點的占用來促進轉錄過程。CREB K290位氨基酸是CREB與鎂離子結合的主要位點，K290突變后能夠增加CREB的接觸表面，從而使CRTC1不僅與CREB bZIP結構域結合，而且與CREB 堿性區相結合，因此提示CREB K290在DNA結合、CRTC1與CREB結合及CREB相關轉錄過程中發揮著重要作用[27]。另外，當細胞內cAMP升高時，可引起CREB S133磷酸化，同時引起CRTC1向胞核內轉移，從而促使CBP和CRTC1分別整合到S133磷酸化區域和bZIP結構域。一些研究發現，CBP-KIX與CRTC1能相互連接發生協同作用，誘導CBP與CRTC1的連接可能會導致CREB上共轉錄因子CBP-CRTC1復合物形成，最終使CRE靶基因表達水平增加[28]。

3 CRTC1在樹突生長發育中的作用

樹突棘是樹突分支上的棘狀突起，是神經元間形成突觸的主要部位。樹突棘的形態和功能變化對神經環路重塑具有重要作用，也是形成突觸可塑性的關健因素。有研究報道，大腦神經元內含量豐富的CRTC1參與樹突生長過程，且CRTC1主要通過腦源性神經營養因子(brain-derived neurophic factor，BDNF)介導對樹突生長發育的調節作用[19,29]。BDNF是一種腦源性神經營養因子，是CREB調控轉錄的靶基因之一，對突觸可塑性的維持和海馬依賴的學習記憶起關鍵作用[30]。BDNF能夠通過激活PI3K和MAPK信號通路誘導初級樹突的形成，此過程暫不需要新蛋白質合成；BDNF也對樹突絲長度和樹突棘密度的增加發揮著關鍵作用，并需要新蛋白質合成[19,31]。BDNF對樹突生長的調節需要CREB Ser133磷酸化，但CREB Ser133磷酸化不足以引起CREB依賴的基因轉錄。由此推測， BDNF促進樹突長度和密度增加的機制包括BDNF誘導的CREB Ser133磷酸化和CRTC1核內轉移。并且，BDNF可能通過受NMDA受體激活調控的CRTC1核內轉移來影響樹突生長發育過程[19]。關于CRTC1參與樹突生長發育調控機制的研究還處于起步階段，仍需進一步的研究。

4 CRTC1在突觸可塑性和學習記憶中的作用

LTP被認為是與學習記憶相關的突觸可塑性的細胞模型，LTP分為早期LTP(early-phase LTP，E-LTP)和晚期LTP(late-phase LTP，L-LTP)。E-LTP僅能持續幾分鐘到1 h，由前體蛋白修飾維持，而L-LTP則能持續幾小時甚至幾天，此過程則需要基因轉錄以及蛋白質的合成[32]。2006年中科院熊志奇教授研究組首次報道CRTC1活動依賴性的細胞核聚集是海馬L-LTP維持的必需過程[12]，且隨后有報道，只有在L-LTP階段，而不是E-LTP，才能引起CRTC1核內及其周圍的聚集[9]。CRTC1通過感受胞內Ca2+和cAMP濃度變化，與CREB協同調控CRE靶基因轉錄，參與L-LTP的維持[12,25]。Ch’ng等[15]發現Ca2+主要促進CRTC1向核內轉移，而cAMP則主要維持CRTC1在細胞核內的表達。CRTC1表達上調，可能會增加K+通道通透性，使神經元興奮性提高，還可增強記憶鞏固和再鞏固過程，且由CRTC1表達上調所致的記憶增強是特異性的，不會對其它新的情景產生記憶增強作用[16]。以上均提示海馬腦區CRTC1是聯系突觸活動和細胞核內基因轉錄的信號分子，CRTC1通過傳遞突觸活動的信號到細胞核介導CRE靶基因表達而維持L-LTP，并參與到記憶過程中。

5 CRTC1和阿爾茨海默病

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種表現為進行性認知功能障礙和神經精神癥狀為主要特征的神經退行性疾病，其發病機制仍未完全清楚。目前較為公認的是，β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein, Aβ)不能被機體及時降解和清除時，逐漸形成可溶性的Aβ寡聚體(oligomer of Aβ)和不溶性的纖維性Aβ(fibrillar Aβ)，進一步沉積形成老年斑，廣泛分布于大腦皮層、海馬等神經細胞之間和腦血管及其周圍，導致腦病理損害的發生[33]。一系列研究表明，無論施加外源性Aβ或內源性產生的Aβ，對在體大鼠或離體腦片的海馬LTP均會產生抑制作用，并可易化LTD[34-36]。Aβ對海馬突觸可塑性損害和突觸丟失的影響可能是通過cAMP-PKA-CREB途徑調控[37-39]。Aβ一方面導致cAMP表達減少，另一方面改變PKA的調節單位或催化單位，進而使CREB磷酸化水平降低。寡聚體Aβ能抑制NMDA和去極化誘導的CREB磷酸化過程。近幾年研究發現Aβ可干擾CRTC1介導的CREB磷酸化過程[40]。

5.1Aβ對CRTC1活動依賴性轉錄的影響 研究證實在APPSw,Ind轉基因鼠神經元中Aβ負性調控CRTC1發揮的效應。對APPSw,Ind轉基因鼠的研究發現，約 6月齡小鼠已出現記憶力下降，此時，通過對其神經元培養可觀察到Aβ40/Aβ42在腦內的聚集，同時還發現CRTC1調控的CRE靶基因(bdnf、c-fos、nr4a2)表達含量下降[10,41]。RT-PCR結果顯示APPSw,Ind轉基因鼠海馬中活動依賴的CREB靶基因如c-fos、bdnfIV、nr4a2及arc缺失會導致長時程空間記憶障礙[42]。通過利用γ-分泌酶抑制劑DAPT抑制Aβ寡聚體的形成，能夠明顯逆轉APPSw,Ind轉基因鼠CRE靶基因轉錄缺陷；應用抗Aβ抗體(Ab20.1)后，卻只能部分地逆轉受損的CRE靶基因轉錄；而增加Aβ的表達則會下調CRTC1依賴的CREB轉錄水平[40]。

5.2Aβ干擾CRTC1活動依賴性轉錄的可能機制 CRTC1是胞內cAMP和Ca2+信號感受器，Aβ干擾CRTC1調控的轉錄機制可能是通過抑制L型電壓依賴性鈣通道，Ca2+內流減少，同時通過調控calcineurin來減少CRTC1 Ser151的去磷酸化[40]。在AD患者和轉基因鼠腦中，calcineurin活動度減低，表達量下降[43]。Aβ削弱CRTC1依賴的靶基因表達，例如c-fos、bdnfIV以及nr4a2，其中，大量研究顯示AD患者及轉基因鼠腦中BDNF表達水平下降。人類大腦皮層內BDNF表達量最高的亞型是BDNF IV，當神經元活動時能夠引起Ca2+內流增加，并且在Aβ形成寡聚體時BDNF IV表達量減少[44]。在SH-SY5Y成神經細胞瘤細胞中，由寡聚體Aβ42所致的BDNF IV表達量下降通常伴隨著CREB磷酸化下降。行為學實驗表明，APP轉基因鼠腦中c-Fos表達量減少常常與學習記憶缺陷相關；下調CRTC1依賴的基因表達，如c-fos、bdnfIV以及nr4a2，常表現出早期長時間空間記憶障礙[40]。AD模型鼠的認知功能障礙伴隨著CRTC1依賴的轉錄水平降低，提示了CRTC1表達下調在AD認知功能障礙中可能發揮著重要作用。近期研究提示，CRTC1基因敲除小鼠在行為上表現為攻擊和抑郁樣表現，提示CRTC1在社會活動和情緒相關的行為中十分重要[45]。綜上所述，CRTC1表達或活性異常可能在AD及其它神經精神系統疾病的發病過程中起重要作用，需要進一步的深入研究，從而為臨床治療提供可能的靶點。

6 展望

目前的研究表明，CRTCs是保證CREB活性的必需條件，并且CRTCs能在細胞核質間穿梭并整合多個通路的信號，把細胞內外的信號直接傳遞到基因的轉錄水平。關于在神經元中CRTC1和其它信號通路分子的crosstalk目前還了解得很少。但與CREB激活的作用相一致，CRTC1被提示也參與神經突觸發育、長時程突觸可塑性和糖代謝過程。雖然已經證實CRTC1在神經形態學和可塑性方面的功能，但CRTC1在與記憶相關的活動依賴性的基因轉錄過程中的作用及分子機制仍不清楚，值得進一步研究。另外，Aβ可能通過影響CRTC1活性干擾與記憶相關的基因轉錄，從而在AD發病過程中發揮重要作用。關于神經精神疾病與CRTC1關系的報道目前較少，進一步研究CRTC1是否參與其它神經精神疾病的發病過程及分子機制的探討應具有重要意義。

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