青海弧菌Q67凍干粉急性毒性測試方法研究

張 煜，王小兵，胡松學(xué)，張朝一，沈光喜

(1.杭州天泉凈水設(shè)備有限公司，浙江杭州 310024；2.上海歐薩評(píng)價(jià)咨詢股份有限公司，上海 200082；3.西湖區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，浙江杭州 310000)

青海弧菌Q67凍干粉急性毒性測試方法研究

張 煜1，王小兵2，胡松學(xué)3*，張朝一2，沈光喜1

(1.杭州天泉凈水設(shè)備有限公司，浙江杭州 310024；2.上海歐薩評(píng)價(jià)咨詢股份有限公司，上海 200082；3.西湖區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，浙江杭州 310000)

[目的]研究利用青海弧菌Q67凍干粉進(jìn)行急性毒性測試的方法。[方法]通過一系列試驗(yàn)，探討青海弧菌Q67凍干粉復(fù)蘇及與毒物反應(yīng)接觸時(shí)間對(duì)毒性測試的影響，篩選出適宜青海弧菌急性毒性測試的毒性參照物，在充分借鑒國際標(biāo)準(zhǔn)ISO 11348的基礎(chǔ)上分析現(xiàn)行發(fā)光抑制率計(jì)算方法的不足，提出了優(yōu)化的計(jì)算方法。[結(jié)果]青海弧菌Q67凍干粉復(fù)蘇的30～120 min內(nèi)進(jìn)行毒性測試，與毒物的反應(yīng)時(shí)間控制在15～20 min時(shí)，測得數(shù)據(jù)穩(wěn)定、可靠。ZnCl2適合用作青海弧菌生物急性毒性測試的毒性參照物。[結(jié)論]該研究為制定青海弧菌Q67凍干粉急性毒性測試標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)。

凍干粉；青海弧菌Q67；測試方法；急性毒性

發(fā)光細(xì)菌生物急性毒性測試法是利用一定濃度范圍內(nèi)，有毒物質(zhì)濃度與發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度變化成一定比例關(guān)系，通過檢測發(fā)光菌與待測物作用前后光強(qiáng)變化來判斷待測物毒性大小的綜合毒性檢測方法，其靈敏度可等同于魚類96 h急性毒性試驗(yàn)[1]。因其快速、靈敏、方便[2]，廣泛應(yīng)用于化學(xué)品[3]、污水[4]、沉積物[5]和土壤[6]等的毒性測試。然而，由于新鮮培養(yǎng)物的使用在現(xiàn)場檢測時(shí)往往受到限制，采用凍干粉復(fù)蘇發(fā)光細(xì)菌檢測將顯得非常必要。現(xiàn)場檢測，凍干粉的復(fù)蘇質(zhì)量及與毒物的反應(yīng)時(shí)間是保證毒性測試準(zhǔn)確性的關(guān)鍵。作為我國特有的淡水發(fā)光細(xì)菌——青海弧菌Q67(Vibrioqinghaiensissp.Q67)，與海洋發(fā)光菌相比，對(duì)NaCl要求不高，pH耐受范圍廣，適宜淡水環(huán)境急性毒性的檢測，目前已有許多學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了研究報(bào)道[7-9]，但采用青海弧菌Q67凍干粉進(jìn)行急性毒性檢測的方法尚不統(tǒng)一，限制了不同研究結(jié)果的比較，且普遍存在測試結(jié)果穩(wěn)定性較差、準(zhǔn)確度不高等問題。筆者在青海弧菌Q67現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，通過一系列試驗(yàn)，探討凍干粉復(fù)蘇、反應(yīng)時(shí)間等因素對(duì)毒性檢測的影響，并篩選出合適的毒性參照物，以期為制定青海弧菌Q67凍干粉急性毒性測試標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 青海弧菌Q67凍干粉購自上海安力康科學(xué)儀器有限公司，全部試驗(yàn)均采用同一批制備物。ZnCl2、K2CrO7、HgCl2、CuCl2·2H2O、NaCl均采用分析純?cè)噭匀ルx子水配制試驗(yàn)所需各濃度，溶液pH 6.0～8.0，滿足青海弧菌對(duì)測試水樣pH的要求[10]。

1.2 試驗(yàn)儀器 包括移液槍、10 ml安瓿瓶、2 ml測試玻璃管、ALK601Q水質(zhì)急性毒性測試儀(上海安力康科學(xué)儀器有限公司)，其中，移液槍量程200～1 000、50～200 μl，購自大龍醫(yī)療設(shè)備(上海)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)溫度控制在20.0～21.0 ℃，空氣相對(duì)濕度50%～60%。

1.3.1 凍干粉復(fù)蘇。Q67凍干粉自-20 ℃冷藏室取出置于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，10 min后加入0.85%生理鹽水(以下簡稱“復(fù)蘇液”)復(fù)蘇、搖勻。1支凍干粉管復(fù)蘇液加入量為550 μl。

1.3.2 毒性測試。測試前，以“待測水樣：滲透壓調(diào)節(jié)液(17%NaCl溶液)=9.5∶0.5”調(diào)節(jié)測試水樣滲透壓。每次測試均設(shè)3個(gè)空白對(duì)照，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行。向每根2 ml測試玻璃管注入50 μl復(fù)蘇菌液，測試發(fā)光強(qiáng)度，記為I0；然后再于玻璃管中注入2 ml測試樣，其中空白對(duì)照管注入2 ml復(fù)蘇液，一定反應(yīng)時(shí)間后測各玻璃管發(fā)光強(qiáng)度，記作IT。測試時(shí)，確保每根玻璃管反應(yīng)時(shí)間一致，且每根玻璃管測試間隔時(shí)間不超過15 s。

1.4 數(shù)據(jù)處理 毒性計(jì)算參照ISO 11348標(biāo)準(zhǔn)[11]，引入自然變化因子fK及校正發(fā)光強(qiáng)度IC，以發(fā)光抑制率HT表征毒性，計(jì)算公式為：fK=空白對(duì)照IT/空白對(duì)照I0、IC=測試樣I0×fK、HT=(測試樣IC-測試樣IT)/測試樣IC×100%。引起青海弧菌發(fā)光強(qiáng)度衰減50%時(shí)的毒物(金屬化合物)劑量EC50，即半最大效應(yīng)濃度，測定時(shí)，以金屬化合物濃度對(duì)青海弧菌Q67發(fā)光抑制率作圖，建立線性回歸方程，計(jì)算EC50值。所有數(shù)據(jù)均由Excel 2003進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)蘇時(shí)間對(duì)青海弧菌Q67菌液發(fā)光的影響 由于現(xiàn)場檢測對(duì)時(shí)效性的要求較高，通常需提前對(duì)凍干粉復(fù)蘇，而不同復(fù)蘇時(shí)間可能對(duì)檢測結(jié)果造成一定影響。為確定其影響程度，試驗(yàn)將剛添加復(fù)蘇液時(shí)菌液的發(fā)光強(qiáng)度記為100%，其余各時(shí)刻發(fā)光強(qiáng)度與之作比，以百分?jǐn)?shù)表示，記為各時(shí)刻“相對(duì)發(fā)光率”。由圖1可知，凍干粉復(fù)蘇的30～120 min內(nèi)，菌液發(fā)光強(qiáng)度基本保持在相同水平。當(dāng)復(fù)蘇時(shí)間<30 min或>120 min時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間迅速增大或減小；發(fā)光強(qiáng)度變化劇烈，數(shù)據(jù)可靠性將降低。因此可認(rèn)為凍干粉復(fù)蘇的30～120 min內(nèi)直接進(jìn)行毒性測試，可得到穩(wěn)定測試結(jié)果。趙洋甬等研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境溫度20 ℃時(shí)，Vibriofischeri凍干粉復(fù)蘇60 min后，發(fā)光強(qiáng)度不及初始光強(qiáng)的20%，且60 min內(nèi)隨復(fù)蘇時(shí)間變化呈顯著負(fù)相關(guān)[12]。與之相比，Q67凍干粉有30～120 min的發(fā)光穩(wěn)定期，且復(fù)蘇210 min后衰減發(fā)光強(qiáng)度尚能達(dá)到初始光強(qiáng)的60%，說明青海弧菌Q67復(fù)蘇菌液活性更強(qiáng)，有利于在現(xiàn)場急性毒性檢測中獲得穩(wěn)定、可靠的測試結(jié)果。

圖1 復(fù)蘇時(shí)間對(duì)青海弧菌Q67復(fù)蘇菌液發(fā)光的影響

2.2 接觸時(shí)間對(duì)毒性測試的影響 目前國內(nèi)外普遍采用的發(fā)光細(xì)菌急性毒性測試中，有關(guān)菌液與毒物反應(yīng)時(shí)間的選擇比較混亂，沒有統(tǒng)一的界定，大大降低了研究結(jié)果的可比性。為了確定合適的反應(yīng)時(shí)間，在此以ZnCl2為被測化合物，測定其EC50值隨反應(yīng)時(shí)間的變化。由圖2可見，隨時(shí)間延長，ZnCl2的EC50值逐漸減小，但在反應(yīng)15 min后，基本保持穩(wěn)定，考慮反應(yīng)時(shí)間過長會(huì)浪費(fèi)時(shí)間且被測樣品組發(fā)光強(qiáng)度均有不同程度上升(反應(yīng)時(shí)間30 min時(shí)樣品組發(fā)光強(qiáng)度是其15 min的140.9%)，因此在應(yīng)用青海弧菌Q67進(jìn)行毒性檢測時(shí)菌液和被測樣品的反應(yīng)時(shí)間應(yīng)控制在15～20 min。王麗莎等以明亮發(fā)光桿菌T3小種測試HgCl2、Zn2+、Cu2+、Mn2+等的EC50值顯示，反應(yīng)時(shí)間在20～30 min時(shí)，各重金屬的EC50值變化較為穩(wěn)定[13]。說明發(fā)光細(xì)菌種類不同，對(duì)毒物的敏感性不同，為獲取穩(wěn)定的測試結(jié)果，對(duì)毒物接觸反應(yīng)時(shí)間的需求就不一致。該試驗(yàn)采用的青海弧菌Q67較明亮發(fā)光桿菌T3小種可提前5 min獲得毒性檢測結(jié)果，這在突發(fā)性污染事故的應(yīng)急監(jiān)測、預(yù)報(bào)中將具有高效性的優(yōu)勢。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)ZnCl2毒性測試的影響

2.3 毒性參照物的篩選 現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法用作毒性參照物的HgCl2具有很強(qiáng)毒性，不僅實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的健康不利，進(jìn)入環(huán)境后將進(jìn)一步危害人類健康及生態(tài)環(huán)境。為此，筆者試圖篩選出更安全的參照物代替HgCl2。除HgCl2外，在此選取3種常見的金屬化合物CuCl2、K2Cr2O7、ZnCl2，在相同試驗(yàn)條件下(凍干粉復(fù)蘇時(shí)間60 min，復(fù)蘇菌液與金屬化合物反應(yīng)時(shí)間15 min)，通過測定EC50值，得到它們的毒性大小為HgCl2(EC50=0.03 mg/L)>ZnCl2(EC50=0.58 mg/L)>CuCl2(EC50=1.89 mg/L)>K2Cr2O7(EC50=3.83 mg/L)(表1)，即HgCl2顯示了最強(qiáng)毒性，ZnCl2和CuCl2毒性次之，此順序與王麗莎等的報(bào)道較為一致[13]。一般認(rèn)為金屬的毒性與其和硫的親和力有關(guān)，金屬與硫的親和力越強(qiáng)，對(duì)有機(jī)體的毒性就越大(如Cu)[8]，但青海弧菌Q67所表現(xiàn)出來的行為不同，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

由表1可知，線性回歸方程的R2值均在0.98以上(P<0.01)，因此，試驗(yàn)中各重金屬化合物樣品濃度與青海弧菌Q67復(fù)蘇菌液發(fā)光抑制率之間線性關(guān)系良好。超出線性范圍，毒物濃度對(duì)青海弧菌Q67發(fā)光抑制率影響無顯著性差別，而HgCl2線性范圍最小，在毒性測試中這將不利于以HgCl2進(jìn)行濃度毒性當(dāng)量評(píng)價(jià)；CuCl2、K2Cr2O7線性范圍較大，但兩者溶液均有顏色，為毒性測試帶來色度干擾，產(chǎn)生附加的發(fā)光抑制讀數(shù)[14]。以各金屬化合物的上述EC50濃度進(jìn)行3次毒性測試，發(fā)現(xiàn)CuCl2、K2Cr2O7、HgCl2三者的毒性穩(wěn)定性不及ZnCl2(表2)。

表1 4種金屬化合物對(duì)青海弧菌Q67的毒性作用

表2 4種金屬化合物的毒性穩(wěn)定性 %

ZnCl23次試驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異系數(shù)最小，即毒性穩(wěn)定性最好。同時(shí)，在pH較大范圍內(nèi)，Zn2+相對(duì)單一、穩(wěn)定[13]，在其線性范圍內(nèi)，能使青海弧菌Q67復(fù)蘇菌液發(fā)光光強(qiáng)產(chǎn)生敏感而又緩和的梯度變化，而其毒性僅為HgCl2的5.7%，毒性大小適中，對(duì)人體和環(huán)境的影響小，因此選擇ZnCl2作為青海弧菌生物急性毒性測試的毒性參照物更合適。

2.4 發(fā)光抑制率計(jì)算的優(yōu)化 發(fā)光細(xì)菌生物急性毒性測試結(jié)果的表示，國內(nèi)現(xiàn)行方法是依據(jù)GB/T 15441-1995《水質(zhì)急性毒性的測定 發(fā)光細(xì)菌法》[15]，以樣品管反應(yīng)發(fā)光光強(qiáng)和空白對(duì)照管反應(yīng)發(fā)光光強(qiáng)的比值計(jì)算發(fā)光抑制率。此方法并不科學(xué)，因?yàn)橐粋€(gè)完整檢測周期，發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度很難保證一直恒定，這需要在分析過程中充分考慮發(fā)光細(xì)菌自身的發(fā)光變化情況。筆者在充分借鑒ISO 11348標(biāo)準(zhǔn)[11]的基礎(chǔ)上，研究通過在試驗(yàn)過程中增加初始發(fā)光光強(qiáng)(I0)的記錄，來獲取發(fā)光細(xì)菌自然變化因子(fK)，并以此校正因發(fā)光細(xì)菌自身發(fā)光強(qiáng)度的變化所帶來的誤差。以現(xiàn)行及優(yōu)化方法處理0.4、0.6、0.8 mg/L 3種濃度ZnCl2溶液對(duì)青海弧菌Q67的發(fā)光抑制率，結(jié)果用“相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差”評(píng)價(jià)，現(xiàn)行方法分別為31.9%、19.7%、20.5%，優(yōu)化后分別為10.9%、4.8%、5.1%，可見，優(yōu)化后的測試結(jié)果平行樣的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均很小(均小于15%)，明顯優(yōu)于現(xiàn)行方法，說明優(yōu)化后測試結(jié)果離散程度小，對(duì)測試物毒性反映的準(zhǔn)確度更高。馬勇等以明亮發(fā)光桿菌502測試不同質(zhì)量濃度苯酚溶液的急性毒性，并對(duì)測試結(jié)果以現(xiàn)行方法及ISO 11348方法處理比較，得出了與該研究相同的結(jié)論[16]。

3 結(jié)論

(1)青海弧菌Q67凍干粉復(fù)蘇的30～120 min內(nèi)直接進(jìn)行毒性測試，有利于得到穩(wěn)定的檢測結(jié)果；以Q67凍干粉進(jìn)行毒性測試時(shí)復(fù)蘇菌液與被測樣品的反應(yīng)時(shí)間應(yīng)控制在不超過30 min，考慮到應(yīng)急監(jiān)測篩查效率的高效性，將15～20 min作為毒性判別的反應(yīng)時(shí)間更為合理。

(2)通過一系列試驗(yàn)的篩選，發(fā)現(xiàn)ZnCl2易溶、穩(wěn)定、價(jià)廉、常見，毒性大小適中，對(duì)人體和環(huán)境的影響小，適合用作青海弧菌生物急性毒性測試的毒性參照物。

(3)發(fā)光抑制率的計(jì)算中，引入自然變化因子fK，并以此校正因發(fā)光細(xì)菌自身發(fā)光強(qiáng)度的變化所產(chǎn)生的誤差，所得數(shù)據(jù)能更穩(wěn)定、可靠地反應(yīng)測試毒物的毒性大小。

(4)該試驗(yàn)均在20 ℃溫度條件下進(jìn)行，而現(xiàn)場急性毒性測試時(shí)，溫度變化不會(huì)保持穩(wěn)定，青海弧菌的適應(yīng)溫度范圍廣(10～30 ℃)[10]，但溫度變化易引起發(fā)光菌生物酶活性的變化，從而影響毒性測試結(jié)果。因此研究環(huán)境因子變化對(duì)青海弧菌生理特性的影響，細(xì)化并綜合不同測試條件下毒性測試方法，將是今后研究工作的重點(diǎn)，對(duì)解決當(dāng)前發(fā)光細(xì)菌急性毒性測試中出現(xiàn)的測試結(jié)果重復(fù)性、再現(xiàn)性較差且準(zhǔn)確度不高等問題有重要意義。

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Study on the Method of UsingVibrioQinghaiensissp.Q67 Freeze-dried Powder to Detect Acute Toxicity

ZHANG Yu, HU Song-xue et al

(Hangzhou Tianquan Water Purification Equipment CO., LTD, Hangzhou,Zhejiang 310024;Xihu District Agricultural Technology Extension and Ser-vice Center, Hangzhou,Zhejiang 310000)

[Objective] The research aimed to explore the method of usingVibrioqinghaiensissp.Q67 freeze-dried powder to detect acute toxicity. [Method] Through a series of tests, in this paper,Vibrioqinghaiensissp.Q67 freeze-dried recovery and toxic reaction time on the influence of the toxicity test was discussed, toxicity reference substance which is suitable for acute toxicity tests withVibrioqinghaiensiswas sifted, and based on full reference to the international standard ISO 11348, analyzing the shortage using current methods to calculate luminescence inhibition rate, optimized methodology was presented. [Result] Test data will be stable and reliable when acute toxicity is detected during 30-120 min fromVibrioqinghaiensissp.Q67 freeze-dried recovery and toxicity reaction time controls in 15～20 min. ZnCl2can be used as toxicity reference in acute toxicity tests withVibrioqinghaiensissp.Q67. [Conclusion] The study provides the theoretical basis for creating methodological standard of usingVibrioqinghaiensissp.Q67 freeze-dried powder to detect acute toxicity.

Freeze-dried powder;Vibrioqinghaiensissp.Q67; Test methods; Acute toxicity

張煜(1983- )，男，湖北荊州人，助理工程師，碩士，從事漁業(yè)水環(huán)境監(jiān)測研究。*通訊作者，高級(jí)工程師，碩士，從事水產(chǎn)動(dòng)物疾病預(yù)防研究。

2014-05-07

S 94

A

0517-6611(2014)15-04746-03