麻風樹葉水浸提液對大豆根細胞的化感效應

王亞男，黃鶴平，鄒志艷，馬丹煒，羅 通，楊 歡，何 兵，張 紅，李 群

(1.四川師范大學生命科學學院，四川成都610101； 2.昆明學院農學院，云南昆明650214；3.宜賓學院生物研究所，四川宜賓644007)

麻風樹(Jatropha curcasLinn.)屬于大戟科大戟屬，原產于中美洲和南美洲，現(xiàn)廣泛分布于中美洲、非洲和亞洲［1］.麻風樹種仁的含油量最高可達61.5%，是一種熱帶地區(qū)極為適宜的生物柴油原料植物［2］，已在薩赫勒地區(qū)和撒哈拉以南的非洲國家以及亞洲國家(中國、泰國、印度尼西亞和印度大部分地區(qū)等)大力推廣種植［3］.2009年6月，中國國家發(fā)展和改革委員會批準了3個以麻風樹籽油為原料的“油林”一體化生物柴油國家示范項目，標志著中國麻風樹生物柴油正式走向了產業(yè)化應用［4］.然而，C.E.Buddenhagen等［5］應用雜草評估系統(tǒng)評估了夏威夷島的40種生物燃料作物的入侵特征，發(fā)現(xiàn)麻風樹具有較高的歸化性和入侵性特征.全球入侵物種編目已經(jīng)把麻風樹歸為高入侵風險植物，雖然尚未對此進行科學論證，但是包括澳大利亞、南非、厄瓜多爾、關島、新喀里多尼亞、印度的部分城市等國家和地區(qū)因此已將麻風樹歸為入侵植物而禁止種植［3］.目前，麻風樹已在中國云南、貴州、四川等地大面積種植，若上述假設成立，麻風樹將對這些地區(qū)的生態(tài)系統(tǒng)形成威脅，因此，正確評價麻風樹的生態(tài)風險迫在眉睫.

化感作用是外來植物主要的入侵機理之一［6-7］.外來植物向周圍釋放化感物質，這些化感物質通過受體植物細胞膜上的受體將化感脅迫信號傳入細胞內部，影響新陳代謝過程［8］，抑制周圍植物的生長發(fā)育.根尖細胞對外界環(huán)境脅迫十分敏感，根邊緣細胞在根表面和土壤界面構建一個生物活性界面，是保護植物根尖免受生物和非生物脅迫的第一道防線［9］.外來入侵植物通過雨霧淋溶、自然揮發(fā)、根系分泌和殘株腐解等途徑向周圍環(huán)境釋放的化感物質最終都將進入土壤［10］，作用于受體植物的根邊緣細胞和根尖細胞.近些年，麻風樹的化感作用引起了國內外學者的關注［11-12］，但麻風樹對植物根尖細胞化感作用的研究較少.鄧騖遠等［13］研究表明麻風樹水浸提液導致蠶豆根尖細胞的畸變率和微核率升高，具有一定的遺傳毒性.本研究在此基礎上，以中國旱地廣泛種植的大豆為受體植物，進一步考察了麻風樹葉水浸提液對其根邊緣細胞、根尖細胞丙二醛(MDA)含量、抗氧化酶活性的影響以及由其誘導的遺傳毒性，以期了解麻風樹釋放的化感物質對根尖及其保護屏障的影響，揭示麻風樹的化感作用機制，為驗證麻風樹是否屬于高入侵風險植物提供相關證據(jù)，并為生物柴油原料植物的可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料供體植物麻風樹葉片采自四川省攀枝花市仁和區(qū)沙溝，采后置于陰涼處陰干；受體植物大豆種子(“鐵豐29號”)購自成都市種子市場.

1.2 水浸提液的制備將陰干后的麻風樹葉片剪成2 cm2左右碎片，裝入錐形瓶中，按照1∶20的比例加入蒸餾水，混勻后在25℃下?lián)u床振蕩48 h，2層紗布過濾2次后，得0.05 g/mL的母液(其他處理質量濃度以此為基礎配制)，放入4℃冰箱備用.實驗設置0.01、0.02、0.03、0.04 和0.05 g/mL 等 5個質量濃度處理水平，以蒸餾水作對照.

1.3 材料培養(yǎng)及處理選擇飽滿、健康無損傷的大豆種子，用蒸餾水漂洗2次，再用質量分數(shù)0.5%KMnO4浸泡消毒10 min，洗凈后用蒸餾水浸種12 h.將充分吸脹的大豆均勻置于鋪有濕潤紗布的潔凈瓷盤中，其上覆蓋一層濕潤紗布，然后放入(25±1)℃的培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)至種子露白.待根長約30 mm時，移至底部墊有濾紙的直徑為12 cm的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿放置15粒種子，其上覆蓋一層濾紙.分別噴入10 mL 0.01～0.05 g/mL麻風樹葉片水浸提液，以蒸餾水作對照，然后蓋上培養(yǎng)皿蓋，置于(25±1)℃培養(yǎng)箱中分別暗培養(yǎng)6、12和24 h，每處理重復3次.培養(yǎng)結束后取樣進行相關指標測定.

1.4 測定指標及方法

1.4.1 大豆根尖果膠甲基酯酶(PME)活性以及根邊緣細胞數(shù)目 1)PME活性:隨機挑選各處理組10個根，剪取2～3 mm的根尖，置于含200 μL的PME提取液(檸檬酸0.1 mol/L、Na3PO40.2 mol/L、NaCl 1 mol/L)的研缽中，冰浴下充分研磨后倒入1.5 mL離心管中，充分振蕩，冰浴2 h，每隔30 min振蕩1次，后置于4℃、15 000 r/min下離心10 min，收集上清液，-20℃保存.PME活性檢測方法參照文獻［14］的方法，PME活性用1 h每個根尖催化果膠釋放1 μmol的H+為一個酶活力單位(用U表示)，重復3次.2)邊緣細胞數(shù)目:隨機挑選各處理組5個根，分別切取5 mm左右的根尖，移至預先裝有100 μL H2O的1.5 mL離心管中，振蕩儀振蕩數(shù)秒，使邊緣細胞在水中充分展開，制成根邊緣細胞懸液.取細胞懸浮液10 μL置于另一0.5 mL的離心管中，依次加入100 μg/mL的溴化乙錠和吖啶橙各2 μL，避光染色2 min，熒光顯微鏡下鏡檢(活細胞為綠色，死細胞為橘紅色)，記錄觀察根邊緣細胞數(shù)目，參考文獻［15］的方法計算細胞數(shù)，重復3次.

1.4.2 大豆根尖細胞抗氧化酶活性 1)粗酶液的提取:分別切取1.3中處理后的根尖0.5 g，加入5 mL pH 7.0的磷酸緩沖液(PBS)冰浴研磨，4℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液即為粗酶液，低溫貯藏備用.2)抗氧化酶活性的測定:超氧化酶歧化酶(SOD)活性采用氯化硝基四氮唑藍法測定［16］；過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定［16］；過氧化氫酶(CAT)活性采用H2O2分解法測定［17］.

1.4.3 大豆根尖細胞MDA含量和微核率1)MDA含量:MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法［18］.稱取一定量的大豆根尖，置于研缽中，加入質量分數(shù)5%三氯乙酸冰浴研磨，10 min后4 000 r/min離心10 min，取上清液備用.取上清液1 mL，加入2 mL質量分數(shù)0.5%硫代巴比妥酸溶液，100℃水浴20 min，迅速冷卻后離心，分別測定上清液在532、600和450 nm處的吸光值.計算MDA的含量.2)微核率:選取根長萌發(fā)至0.5 cm左右的種子，置于底部墊有濾紙的直徑為12 cm的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿放置15粒種子，其上覆蓋一層濾紙.分別噴入10 mL 0.01～0.05 g/mL各設置質量濃度麻風樹葉片水浸提液，蓋上培養(yǎng)皿蓋，于(25±1)℃培養(yǎng)箱中，暗培養(yǎng)6、12和24 h，然后用蒸餾水浸洗3次，每次3 min，移至(25±1)℃恒溫箱中恢復培養(yǎng)24 h，然后切取長度為1 cm左右的根尖用Carnoy固定液固定24 h，質量分數(shù)70%乙醇于4℃保存?zhèn)溆?取固定根尖用1 mol/L HCl 60℃解離，Schiff試劑染色，壓片后鏡檢，每個根尖計數(shù)1 000個細胞，每個處理組統(tǒng)計5個根尖.微核率用根尖分生區(qū)間期細胞出現(xiàn)微核的百分率表示.

1.5 數(shù)據(jù)處理應用SPSS 18.0軟件進行方差分析(ANOVA)和多重比較(LSD法).

2 結果與分析

2.1 麻風樹葉水浸提液對大豆根尖邊緣細胞的影響

2.1.1 邊緣細胞數(shù)目 邊緣細胞是從根冠表皮游離出來并聚集在根尖周圍的一群特殊細胞，是保護植物根尖的第一道防線［19］.麻風樹葉水浸提液對大豆根邊緣細胞數(shù)目的影響見表1.與對照相比，各處理時間段大豆根邊緣細胞的數(shù)量均表現(xiàn)出隨著葉水浸提液質量濃度的升高而先增高后降低的趨勢，且處理間存在顯著性差異(P＜0.05).其中，水浸提液處理6 h后，各劑量組根邊緣細胞的數(shù)量均顯著高于對照，并在0.01 g/mL處理組達到最高值，比對照顯著提高107%；處理12和24 h時，細胞數(shù)目分別在0.01和0.02 g/mL質量濃度處理時達到最大值，此時分別比對照顯著提高35%和27%.這表明大豆根尖在受到麻風樹葉水浸提液脅迫時，可產生大量根邊緣細胞；隨著麻風樹葉水浸提液質量濃度的增加，根邊緣細胞總數(shù)降低；水提液質量濃度超過0.04 g/mL，12和24 h處理組細胞總數(shù)顯著低于對照，同時通過溴化乙錠和吖啶橙染色觀察到各處理組有大量邊緣細胞死亡(數(shù)據(jù)未列).

表1 麻風樹葉水浸提液對大豆根尖邊緣細胞數(shù)目和PME活性的影響Table 1 Effects of aqueous leaf extracts of Jatropha curcas on the number of root border cells and PME activity of soybean

2.1.2 根冠PME活性 根冠PME在根緣細胞的發(fā)育中有重要作用，其活性與根緣細胞的產生和誘導呈正相關［20］.大豆根尖PME活性隨麻風樹葉水浸提液質量濃度的增加均表現(xiàn)為逐漸升高的趨勢(表1)，除處理24 h的0.01、0.02和0.03 g/mL處理組水浸提液對大豆根冠PME活性影響不顯著外，其余處理質量濃度和處理時間下的大豆根冠PME活性均顯著高于對照(P＜0.05).通過比較發(fā)現(xiàn)，6 h處理組PME活性的上升幅度較大.

2.2 麻風樹葉水浸提液對大豆根細胞抗氧化酶活性的影響細胞內的抗氧化酶系統(tǒng)主要包括SOD、CAT和POD等，能夠將細胞內的氧自由基控制在0.2%左右，使機體免遭氧自由基的損傷［21］.麻風樹葉水浸提液對大豆根細胞抗氧化酶活性具有一定的影響(圖1)，其中，SOD和POD活性隨質量濃度變化的趨勢基本一致，均表現(xiàn)為隨著麻風樹葉水浸提液質量濃度的升高先降低后升高，而CAT活性的變化趨勢較為復雜.在處理時間較短時(6 h)，CAT活性隨著葉水浸提液質量濃度的升高而表現(xiàn)出降低—升高—降低的趨勢；隨著處理時間延長(12和24 h)，CAT活性則整體表現(xiàn)為下降的趨勢.各處理時間下各處理質量濃度組的SOD活性均與對照無顯著差異(P＞0.05)；除了6 h處理組的0.03和0.04 g/mL、12 h處理組的0.01和0.02 g/mL外，6 h處理組和12 h處理組各處理質量濃度，大豆根尖POD活性均與對照存在顯著差異(P＜0.05)，而24 h處理組則無顯著變化(P＞0.05)；除0.05 g/mL水浸提液處理24 h的大豆根尖CAT活性與對照差異顯著(P＜0.05)外，其余處理和時間均未達到顯著性差異.

2.3 麻風樹葉水浸提液誘導的膜脂過氧化和遺傳損傷

2.3.1 MDA含量 MDA是機體受到氧化脅迫時，脂質過氧化的最終產物［22］.在麻風樹葉水浸提液作用下，大豆根尖細胞MDA含量的變化如圖2所示.整體來看，在24 h處理組中，隨著麻風樹葉水浸提液質量濃度的升高，大豆根尖細胞中MDA含量先增加后減少；而6和12 h處理組變化趨勢不明顯，各處理組大豆根尖MDA含量的差異均未達到顯著性差異(P＞0.05).這些結果說明，麻風樹水浸提液未引起大豆根尖細胞膜質過氧化.

圖1 麻風樹水浸提液對大豆根細胞抗氧化酶活性的影響Fig.1 Effects of leaf aquatic extracts from Jatropha curcas on the activities of antioxidant enzymes of soybean

圖2 麻風樹水浸提液對大豆根細胞MDA含量的影響Fig.2 Effects of leaf aquatic extracts from Jatropha curcas on MDA contents of soybean

2.3.2 微核率 微核是染色體畸變在間期細胞中的一種表現(xiàn)形式，通過觀察微核的形成來檢測遺傳毒性［23］.麻風樹葉片水浸提液可誘導大豆根尖細胞出現(xiàn)微核(表2).3個處理時間中，不同處理質量濃度的大豆根細胞微核率均顯著高于對照組(P＜0.05).當水浸提液質量濃度為0.03 g/mL時，微核率達到最大，隨著處理液質量濃度進一步升高，微核率有所下降，可能是由于水浸提液細胞毒性強，阻止根尖細胞有絲分裂的進行.

3 討論

3.1 麻風樹對根邊緣細胞的化感效應根邊緣細胞是當根尖浸入水中時能擴散到懸浮液中的那些細胞，由根冠細胞發(fā)育而來.根冠PME與根邊緣細胞的釋放具有密切的關系.根邊緣細胞及其相關的黏液層在植物生長過程中起到多重功能，并在抵抗生物與非生物脅迫中起作用［9，24］.進入土壤的化感物質需要先突破根邊緣細胞這層保護屏障后，才能作用于根尖細胞并干擾其生命活動過程.在入侵植物反枝莧(Amaranthus retroflexusL.)［25］、加拿大蓬(Erigeron canadensisL.)［26］和土荊芥(Chenopodium AmbrosioidesL.)［27］化感脅迫下，隨著處理質量濃度(劑量)升高，受體植物根邊緣細胞存活率下降，根冠PME活性升高.本研究結果與此一致，在短時間(6 h)受到麻風樹水浸提液作用時，大豆幼根通過提高PME活性加快釋放根邊緣細胞，由根邊緣細胞及其黏液層中和化感物質，來緩解麻風樹的化感脅迫.但是隨著處理時間延長(12和24 h)和水浸提液質量濃度的增加，雖然根尖PME活性仍很高，但根邊緣細胞數(shù)目有所降低，表明面對脅迫植物所接受的信號可能是對根邊緣細胞的大量需求，因此通過反饋繼續(xù)提高PME的表達，但由于其已大大超過根尖產生新根邊緣細胞的能力，所以根邊緣細胞數(shù)目降低，同時試驗中觀察到根邊緣細胞大量死亡，表明麻風樹水浸提液對根邊緣細胞具有細胞毒性.

3.2 麻風樹對根尖細胞的化感效應許多植物的化感物質具有遺傳毒性和細胞毒性，影響細胞的有絲分裂過程［28-30］.微核試驗是檢測染色體或有絲分裂器損傷的一種遺傳毒性試驗方法［23］.無著絲粒的染色體片段或因紡錘體受損而丟失的整個染色體，在細胞分裂后期仍留在子細胞的胞質內成為微核.微核為游離于主核之外且和主核著色一致圓形或橢圓形的細胞內結構.胡琬君等［31］發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同劑量土荊芥揮發(fā)油處理后，蠶豆根尖細胞出現(xiàn)多種類型的染色體畸變，微核率顯著高于對照，在一定范圍內呈現(xiàn)劑量效應和時間效應.本課題組前期研究表明［13］，麻風樹水溶性化感物質具有較強的遺傳毒性.在麻風樹葉水浸提液作用下，蠶豆根尖細胞出現(xiàn)染色體畸變現(xiàn)象，微核率和畸變率均明顯高于對照.本研究進一步印證了這一結論，大豆根尖細胞的微核率隨著麻風樹水浸提液處理時間和處理質量濃度增加而升高.當質量濃度大于0.03 g/mL后，微核率雖然有所下降，由于水提液對大豆根尖細胞毒性較強，阻止其有絲分裂的進行，導致微核率有所下降，但仍然高于對照，表明麻風樹水浸提液對大豆根尖細胞具有遺傳毒性.同時本研究結果表明，麻風樹水浸提液未誘導大豆根尖細胞的氧化損傷，提示其可能表現(xiàn)為直接的遺傳毒性，引起DNA損傷或破壞了紡錘絲的結構與功能，由此形成的染色體斷片或滯后染色體，在子核重建時形成了游離于主核的微核.

表2 麻風樹葉水浸提液對大豆根尖細胞微核率的影響Table 2 Effect of the leaf aqueous extracts from Jatropha curcas on micronucleus rate of soybean root tip cells

綜上所述，麻風樹水浸提液對大豆根尖抗氧化系統(tǒng)的影響不大，但表現(xiàn)出較強的細胞毒性和遺傳毒性.當麻風樹的化感物質釋放到環(huán)境以后，通過降低受體植物根邊緣細胞的存活率，干擾根邊緣細胞的保護功能，進而影響受體植物根尖細胞有絲分裂過程，最終導致受體植物生長發(fā)育受阻.因此，在大規(guī)模引種麻風樹前，應對其潛在生態(tài)風險做預警分析.

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