酸敏感離子通道在中樞化學感受器呼吸調節中的作用*

李 麗， 劉文彥， 高 波

(1濟寧醫學院基礎醫學教研室，山東 日照 276826； 2濟寧醫學院生理學教研室，山東 濟寧 272100)

中樞化學感受器位于延髓腹外側的淺表部位，當其局部的細胞外液中或腦脊液中[H+]升高時，可使其受到刺激，并將信號傳至呼吸中樞引起呼吸加深加快的反應。血液中的CO2能迅速透過血-腦脊液屏障，與腦脊液中的H2O在碳酸酐酶的作用下反應生成H2CO3，然后解離出H+，間接刺激中樞化學感受器進而引起呼吸興奮的效應[1]。因此，中樞化學感受器能特異地感受[H+]的變化，進而對呼吸產生重要的調節作用，但目前對于中樞化學感受器呼吸調節的機制尚不完全清楚。酸敏感離子通道(acid sensing ion channels, ASICs)是一類存在于細胞膜上的蛋白復合體，屬于非電壓門控的對Na+有高度通透性的離子通道，由細胞外酸化激活，可以特異地感受[H+]的變化，并在外周和中樞廣泛表達。ASIC1a是ASICs的一種亞型，當pH值小于6.9時，ASIC1a即可被激活，并能被PcTx1特異性阻斷[2]。由此我們推測，ASICs尤其是ASIC1a可能在由中樞化學感受器介導的呼吸調節中發揮重要作用。因此，在本研究中，以膈肌肌電為指標，通過腦室內注射酸化人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid, aCSF)，觀察中樞化學感受器受到刺激時呼吸的變化；然后通過腦室內注射ASICs的阻斷劑阿米洛利和ASIC1a特異性阻斷劑PcTx1，觀察阿米洛利和PcTx1對腦室內注射酸化aCSF所致呼吸效應的影響，以期探討ASICs在中樞化學感受器呼吸調節中的作用。

材 料 和 方 法

1 動物與主要試劑

實驗選用健康成年SD大鼠共30只，雌雄不限，體重250～300 g，由山東大學實驗動物中心提供。

阿米洛利(amiloride)購自Sigma，PcTx1購自Spider Pharm。

2 方法

2.1實驗分組 健康成年SD大鼠隨機分為6組，aCSF(pH 7.4)對照組(4只)、aCSF(pH 6.5)組(6只)、amiloride對照組(4只)、amiloride+aCSF(pH 6.5)組(6只)、PcTx1對照組(4只)及PcTx1+aCSF(pH 6.5)組(6只)。

2.2側腦室注射 所有動物經氨基甲酸乙酯(1 g/kg)腹腔注射麻醉后，將大鼠固定在手術臺上，行頸部氣管插管，切斷雙側迷走神經，一側股動脈插管以監測血壓，于劍突下打開腹腔并暴露膈肌，并在膈肌上找到合適位置連接電極，以膈肌肌電記錄呼吸運動的變化。 然后以先固定雙耳、再固定門齒的順序將大鼠固定在腦立體定位儀中以保持大鼠頭位的水平。參照Paxinos和Watson的《鼠腦立體定位圖譜》，以Bregma點向后1.0 mm、中線旁開1.5 mm處為穿刺點，通過微量進樣器垂直進針3.5～4.0 mm向側腦室內緩慢勻速注射藥物。aCSF(pH 7.4)對照組注射aCSF(pH 7.4) 10 μL；aCSF(pH 6.5)組注射aCSF(pH 6.5) 10 μL；amiloride對照組注射amiloride(10 mmol/L)10 μL；amiloride+aCSF (pH 6.5)組注射amiloride(10 mmol/L)10 μL后立刻注射aCSF(pH 6.5)10 μL；PcTx1對照組注射PcTx1(10 nmol/L)10 μL；PcTx1+aCSF(pH 6.5)組注射PcTx1(10 nmol/L)10 μL后立刻注射aCSF(pH 6.5)10 μL。

2.3觀察指標 所有動物在手術基本結束、微量進樣器藥物注射前恢復30 min。自微量注射器注射藥物前 5 min、注射藥物即刻及注射藥物后每5 min監測1次血壓和呼吸，每次監測1 min，呼吸和血壓均經BL-420生物機能實驗系統進行觀察和分析。股動脈平均壓(mean blood pressure, MBP)以mmHg表示，膈肌肌電呼吸的變化以吸氣時程(inspiratory time, TI)、呼氣時程(expiratory time, TE)、呼吸頻率(respiratory frequency, RF)和吸氣幅度(amplitude of inspiration, Amp)為指標進行觀察。

2.4注射部位鑒定 實驗結束后，向腦室內注入20 g/L美藍溶液0.5 μL并處死動物開顱取腦，100 mL/L甲醛固定24 h，切開鑒定藥物注射部位，凡未注入側腦室的動物結果棄去。

3 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS分析軟件，通過兩均數比較t檢驗,對結果進行統計分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

所有動物在注射藥物前后血壓無顯著變化(P>0.05)，見表1。aCSF(pH 7.4)對照組動物、amiloride對照組動物及PcTx1對照組動物藥物注射前后呼吸無明顯變化(P>0.05)；aCSF(pH 6.5)組及PcTx1+aCSF(pH 6.5)組動物，藥物注射時呼吸無明顯變化，藥物注射5 mim后開始出現呼吸興奮，但尚未有統計學差異(P>0.05)，藥物注射10 min后呼吸明顯興奮(P<0.05)，藥物注射15 min呼吸興奮程度明顯減弱，與注射藥物前無顯著差異(P>0.05)，藥物注射后20 min呼吸基本恢復正常；amiloride+aCSF(pH 6.5)組動物藥物注射前后無明顯變化(P>0.05)，見表1、圖1。aCSF(pH 6.5)組動物及PcTx1+aCSF(pH 6.5)組動物在藥物注射后10 min，計算其TI、TE、RF、Amp的變化率(injection 10-pre-injection)/pre-injection×100%，結果顯示PcTx1+aCSF(pH 6.5)組的動物以上數據的變化率明顯低于aCSF(pH 6.5)組的動物，即藥物注射10 min后呼吸興奮程度明顯低于aCSF(pH 6.5)組動物(P<0.05)，見表2。

Figure 1. The effect of amioride and PcTx1 on the respiratory reactions induced by intracerebroventricular injection of aCSF (pH 6.5) in the rats. A: injection of aCSF (pH 6.5); B: injection of PcTx1 plus aCSF (pH 6.5); C: injection of amiloride plus aCSF (pH 6.5).

表1 Amiloride和PcTx1 對腦室內注射aCSF(pH 6.5)所致的呼吸效應和股動脈平均壓的影響

表2 PcTx1對腦室內注射aCSF(pH 6.5)引起呼吸效應變化的影響

討 論

1 腦室內注射aCSF(pH 6.5)對呼吸的影響

在本研究中，腦室內注射aCSF(pH 6.5)后10 min TI、TE明顯縮短，RF明顯增快，Amp明顯增大，即呼吸出現明顯興奮，而腦室內注射aCSF(pH 7.4)后呼吸沒有明顯變化，提示呼吸興奮的出現是腦室內注射酸化aCSF所致。腦室內注射aCSF(pH 6.5)后造成腦脊液中[H+]升高，可直接刺激位于延髓腹外側淺表部位中樞化學感受器頭端區和尾端區的化學敏感神經元，并將此信號傳至腦干呼吸中樞，引起呼吸興奮[3]。近年來的研究表明，斜方體后核、孤束核、藍斑及下丘腦等部位也存在化學敏感神經元，當它們受到酸化刺激時也會引起呼吸興奮[4]。

2 Amiloride對腦室內注射aCSF(pH 6.5)引起的呼吸效應的影響

ASICs屬于非電壓門控的對Na+有通透性的離子通道，由細胞外酸化激活，在外周和中樞神經系統廣泛表達。目前的研究表明，ASICs有ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3及ASIC46種亞型，在外周與觸覺、酸味覺、視覺及傷害性刺激的感知有關，在中樞與腦組織缺血缺氧、癲癇等病理過程有關。6種亞型都可被阿米洛利阻斷[5]。在本研究中，腦室內先注射amiloride，隨后注射aCSF(pH 6.5)，呼吸并未表現出明顯的興奮，而腦室內單獨注射amiloride，呼吸也未出現明顯的變化，提示amiloride對正常呼吸不存在明顯的影響，但能阻斷腦脊液酸化后引起的呼吸興奮效應。這與宋娜娜[6]在中樞化學感受器-延髓腹外側淺表部位微量注射amiloride 后注射酸化aCSF引起的呼吸效應基本一致。由此可知，ASICs是參與中樞化學感受器呼吸調節的關鍵通道，但究竟是ASICs哪一種亞型在此過程中起主要作用，還有待進一步的研究證實。

3 PcTx1對腦室內注射aCSF (pH 6.5)引起的呼吸效應的影響

ASIC1a是ASICs的一種亞型，當細胞外液pH值小于6.9時即可被激活，隨即引發快速激活及快速失活的電流，主要通透鈉離子，在腦及感覺神經元廣泛表達。PcTx1最初是從一種南美洲狼蛛千里達老虎尾的毒腺中提取的毒素，能特異性阻斷ASIC1a[7]。在本研究中，腦室內注射PcTx1，隨后注射aCSF(pH 6.5)，呼吸興奮程度較單獨注射aCSF(pH 6.5)明顯減弱，而腦室內單獨注射PcTx1呼吸沒有出現明顯的變化，提示ASIC1a在腦室內注射aCSF(pH 6.5)引起的呼吸效應中發揮了部分作用。

綜上所述，腦室內注射酸化aCSF能刺激中樞化學感受器引起呼吸興奮，ASICs是參與此過程的關鍵離子通道，而ASIC1a在此過程只發揮了部分作用，推測ASICs其它的亞型也參與了此過程。

[參 考 文 獻]

[1] 鄭 煜. 呼吸[M]∥朱大年.生理學. 第8版. 北京： 人民衛生出版社，2013：177-185.

[2] 李 麗. 酸敏感的離子通道研究簡介[J]. 中華生物醫學工程雜志, 2010, 16(1):79-82.

[3] Guyenet PG, Abbott SB. Chemoreception and asphyxia-induced arousal[J]. Respir Physiol Neurobiol, 2013, 188(3):333-343.

[4] Guyenet PG, Abbott SB, Stornetta RL. The respiratory chemoreception conundrum: light at the end of the tunnel[J]. Brain Res, 2013, 1511:126-137.

[5] Benarroch EE. Acid-sensing cation channels: structure, function, and pathophysiologic implications[J]. Neurology, 2014, 82(7):628-635.

[6] 宋娜娜.中樞酸敏感離子通道對呼吸的調節及機制研究[D].上海： 復旦大學,2010.

[7] Diochot S1, Salinas M, Baron A, et al. Peptides inhibitors of acid-sensing ion channels[J]. Toxicon, 2007, 49(2):271-284.