siRNA對預分化骨髓間充質干細胞β2M表達的影響*

戴 兵， 范時洋， 陳 龍， 金海東， 蔡建武， 潘 駿

(溫州醫科大學附屬第二醫院骨科, 浙江 溫州 325027)

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)具有多向分化潛能，特定培養條件下可分化為成骨細胞、軟骨細胞、肌腱細胞、內皮細胞、真皮細胞、神經細胞等中胚層組織[1]，是組織工程理想的種子細胞。鑒于自體細胞臨床大范圍應用的限制，異體種子細胞的免疫逃逸問題是組織工程發展無法回避的問題之一。MSCs隨具有低免疫原性，但植入體內的干細胞可以分化為多種類型的細胞，干細胞的分化是否影響其免疫原性的表達，這是我們要考慮的問題。對影響細胞移植成功的主要障礙是T細胞介導的免疫應答。MHC I分子和CD8+T細胞的相互作用在同種異體或異種移植的排斥反應中起到重要作用[2-3]。BMSCs只表達MHCⅠ，不表達MHCⅡ， MHCⅠ在免疫系統中占有極其重要的地位，廣泛表達于一切有核細胞表面，由重鏈α鏈和輕鏈β2-微球蛋白(beta 2-microglobulin, β2M)組成。 β2M是一種低分子量的蛋白質，與重鏈ɑ鏈以非共價鍵連接方式相連，使MHCⅠ在細胞表面能夠穩定表達，并能促進抗原肽與MHCⅠ結合[4-6]。RNAi技術是特異性降解與其序列相應的單個內源基因的mRNA[7]。近年來，使用RNAi技術阻斷特定基因的表達比反義寡核苷酸等更特異、高效、穩定和低濃度[8-9]。通過RNAi減少或下調MHC I分子蛋白的表達，成功克服了一些限制細胞治療的免疫反應[10]。我們擬通過RNAi技術使預分化BMSCs的β2M沉默，降低β2M蛋白的表達，為軟骨組織工程提供低免疫原性的種子細胞。

材 料 和 方 法

1 動物和材料

健康雄性清潔級4周齡SD大鼠10只，體質量200～240 g，購自溫州醫科大學實驗動物中心，有關動物實驗的相關內容通過了溫州醫科大學倫理委員會的審批。

低糖DMEM和胎牛血清購自Sigma；SD大鼠骨髓間充質干細胞成軟骨誘導液購自廣州賽業；抗生素和抗真菌劑溶液購自Life Technologies；Lipofectamine 2000購自Gibco；FAM-siRNA及轉染相關試劑均購自上海吉瑪公司;siRNA的序列見表1；β2M 抗體和兔抗羊 IgG-HRP均購自 Santa Cruz；GAPDH antibody購自Bioworld；總RNA快速提取試劑盒購自Generay；逆轉錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas；qPCR試劑IQ SYBR Green Supermix購自Bio-Rad。所用引物由上海英濰捷基(Invitrogen)有限公司根據設計合成，見表2。

表1 siRNA序列

表2 引物序列

2 主要方法

2.1骨髓間充質干細胞的分離培養 無菌操作下取4周齡SD大鼠股骨及脛骨干，用一次性注射器吸取無血清DMEM培養基反復沖洗骨髓腔，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入含10% FBS、1%雙抗的DMEM培養基吹打混勻后移入25 cm2培養瓶內，置37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養箱內培養，24 h后除去未貼壁細胞，以后每3～4 d更換培養基，待細胞鋪滿瓶底80%以上，0.25%胰酶/0.1% EDTA消化細胞，1 000 r/min離心5 min，按1∶3傳代培養。

2.2細胞成軟骨誘導 取第3代MSCs加入含10% FBS成軟骨誘導液(含基本培養基97 mL, 地塞米松10 μL, 抗壞血酸鹽300 μL, 胰島素-轉鐵蛋白-硒1 mL, 丙酮酸鈉鹽100 μL, 脯氨酸100 μL, TGF-β31 mL)，置37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養箱內培養，3 d更換培養基，誘導21 d，終止誘導。

2.3細胞轉染 實驗所需β2MsiRNA由上海吉瑪公司設計合成，實驗分為5組：實驗組3組，分為siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3組；對照組2組，分為空白對照組 (negative control,NC)和非特異siRNA組(non-specific siRNA,NS)。取成軟骨誘導21 d的MSCs，種植于放置細胞爬片的24孔板中(5×104cells/well)，培養24 h后進行轉染。實驗組和非特異siRNA組每孔轉染體積100 μL(轉染方法參照Lipofectamine 2000說明書)，對照組每孔加等體積的無血清opti-MEM I培養基，避光培養。

2.4Western blotting法檢測β2M蛋白表達 冷的PBS洗滌細胞2遍，冰上裂解細胞、離心并收集上清后行蛋白定量，采用10% SDS-PAGE凝膠電泳。蛋白分離后經恒流電轉移到PVDF膜，使用含5%脫脂牛奶的封閉液室溫封閉1 h，與β2M抗體4 ℃孵育過夜，次日加入Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，取出膜后加入ECL發光液，移入凝膠成像分析儀，化學光敏模式曝光顯影。

2.5實時熒光定量PCR 收集各組細胞，總RNA抽提按Trizol試劑說明書操作，分光光度計測量RNA的純度及濃度，使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄為cDNA，采用SYBR Green染色法，以各組cDNA為模板，加入緩沖液、引物等進行PCR，各樣本重復3次。反應條件如下：95 ℃變性2 min,95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，循環40次。

2.6激光共聚焦顯微鏡下觀察β2M 取對照組和siRNA-3組細胞用PBS洗2遍，5% BSA 室溫封閉1 h，PBS洗3遍。孵育β2M熒光Ⅰ抗, 37 ℃避光1 h, PBS洗2遍。10 μL DiI染色, 室溫, 避光15 min, PBS洗2遍，30%甘油封片。

2.7甲苯胺藍染色檢測蛋白聚糖多聚體 轉染24 h后，吸去原液， PBS 洗細胞3遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗細胞2遍，加入 1 mL 甲苯胺藍染液覆蓋細胞表面，室溫下孵育 30 min，PBS 洗細胞2遍，常規乙醇脫水、透明及30%甘油封片。倒置顯微鏡下觀察細胞，拍照。

2.8Ⅱ型膠原(collagen type Ⅱ,Col Ⅱ)免疫熒光 轉染12 h后，吸去原液， PBS 洗細胞3遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗細胞2遍，0.2% Triton X-100破膜30 min，PBS 洗細胞2遍；5% BSA固定1 h，PBS洗細胞2遍；以0.1% Triton X-100稀釋Col II Ⅰ抗(1∶100)，37 ℃孵育細胞1 h，PBS洗細胞2遍；以0.1% Triton X-100 稀釋FITC熒光Ⅱ抗(1∶500)，37 ℃孵育細胞1 h，PBS洗細胞2遍；以10 μg/L的DAPI標記孵育15 min，標記細胞核，PBS洗細胞2遍；熒光顯微鏡下觀察細胞，拍照。

3 統計學處理

采用SPSS 18.0軟件分析。數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間均數比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 不同siRNA對 β2M mRNA表達的影響

將MSCs成軟骨誘導21 d后，進行siRNA干擾。siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3各轉染組均比對照組細胞的β2M mRNA表達有不同程度降低。siRNA-3組細胞的目的基因表達減少最明顯，siRNA-2和siRNA-1次之(P<0.01)，見圖1。

2 不同siRNA對 β2M蛋白表達的影響

Western blotting結果表明,siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3各轉染組均比對照組細胞的β2M蛋白表達有不同程度降低。siRNA-3組細胞目的蛋白含量減少最明顯，siRNA-2和siRNA-1次之(P<0.01)，表明用3種siRNA均成功沉默BMSCs的β2M基因表達，siRNA-3的沉默效果最佳，見圖2。

Figure 1. The mRNA expression of β2M in the pre-differentiated (21 d) BMSCs determined by real-time qPCR analysis.NC: negative control; NS: non-specific siRNA; 1: siRNA-1; 2: siRNA-2; 3: siRNA-3.Mean±SD.n=3. **P<0.01 vs NC or NS.

Figure 2. The protein expression of β2M in the pre-differentiated (21 d) BMSCs determined by Western blotting.NC: negative control; NS: non-specific siRNA; 1: siRNA-1; 2: siRNA-2; 3: siRNA-3.Mean±SD.n=3. **P<0.01 vs NC or NS.

3 激光共聚焦顯微鏡下觀察β2M

成軟骨誘導液中培養21 d后，對照組和siRNA-3 轉染組細胞的β2M分布均比較均勻， siRNA-3 轉染組的BMSCs相比未轉染組β2M明顯減少，表明β2MsiRNA可有效沉默β2M基因的表達，見圖3。

Figure 3. The protein expression of β2M in the pre-differentiated (21 d) BMSCs observed by laser confocal microscopy.Scale bar = 50 μm.

4 甲苯胺藍法染色觀察

甲苯胺藍法染色顯示：成軟骨誘導21 d后，NC組和siRNA-3組的BMSCs蛋白聚糖多聚體染色均呈陽性反應，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖4。

Figure 4. Aggrecan production in the pre-differentiated (21 d) BMSCs detected by toluidine blue staining. Scale bar = 50 μm.A: NC; B: siRNA-3.

5 Ⅱ型膠原免疫熒光

Ⅱ型膠原免疫熒光顯示：成軟骨預誘導21 d后，BMSCs呈多角形，細胞形態清晰，NC組預誘導BMSCs細胞的Ⅱ型膠原免疫熒光強度較siRNA-3轉染組的細胞略低，但差異無統計學意義(P>0.05)，見圖5。

討 論

在長期移植過程中，考慮到免疫反應，自體細胞是理想的移植供體細胞。其中，BMSCs因其在哺乳動物體中含量豐富，具有顯著的優勢。BMSCs因其取材方便、體外擴增能力強，具有多向分化潛能、不涉及倫理道德問題等優點，受到廣泛關注[11]。然而自體移植前，細胞的分離、擴增往往十分耗時。這種情況下，同種異體BMSCs因其低免疫原性而成為軟骨移植較好的種子來源。BMSCs移植應用于臨床將是一個漫長的過程，一旦應用于臨床，那么對患者來說有很大好處。充足的種子細胞儲存，避免了不必要的自體細胞分離擴增，更能滿足不適合自體BMSCs移植的老人的需求。近年來越來越多的研究主要集中在同種異體BMSCs的使用上。

Figure 5. Collagen type II in the pre-differentiated (21 d) BMSCs detected by immunofluorescence. Scale bar = 50 μm.A: NC; B: siRNA-3.

來源于成人的BMSCs已被證明具有免疫調節活性。比如可以抑制T細胞增殖，調節B細胞功能和樹突狀細胞的成熟[12]。但是移植的異體BMSCs在特定環境分化過程中，免疫原性是否發生變化呢？Huang等[13]發現預分化的骨髓間充質干細胞相比未分化的骨髓間充質干細胞，增加了免疫原性。其他研究小組證實，將異體間充質干細胞移植到幼齡小鼠[14-15]和豬[16]體內會引起免疫反應。這說明植入的同種異體BMSCs雖然具有低免疫原性，但在體內分化過程中，其免疫原性是增加的，使得它們更易受到免疫排斥。

Isakova等[17]發現將MHCⅠ陽性的雄性獼猴的骨髓間充質干細胞移植到雌性幼齡獼猴中樞系統，引起急性移植排斥反應。但是敲除MHCⅠ或MHCⅡ或兩者同時敲除的小鼠胚胎神經元，其免疫原性降低，移植到大鼠腦中可長期存活[18-19]，這些證據說明，抑制MHCⅠ的表達對于BMSCs移植的安全性至關重要。MHCⅠ分子存在于所有有核細胞，包括重鏈α鏈和輕鏈β2M，α鏈和β2M都是MHCⅠ分子折疊、加工所必須的。有研究表明在缺乏β2M的情況下，細胞的表面不能有效表達MHC I分子[20-21]，這為降低細胞免疫原性提供了新的途徑。

siRNA具有高效、特異、低毒、周期短、操作簡單等特點，作用于哺乳動物細胞蛋白表達上游的mRNA，是傳統的基因敲除技術所不能比擬的。本研究針對β2M mRNA序列，設計了3對β2MsiRNA。Lipofectamine 2000因其轉染效率高、安全等特點，目前得到了廣泛應用。我們使用Lipofectamine 2000作為載體成功將siRNA安全、完整地轉入到BMSCs。通過Western blotting、實時定量PCR和激光共聚焦顯微鏡觀察分析發現轉染的預分化BMSCs，其β2M的表達明顯下降，其中以siRNA-3的抑制效果最佳。

那么β2MsiRNA轉染后對預分化的BMSCs是否有影響呢？基于這方面的考慮，我們選取轉染24 h的細胞進行甲苯胺藍和Ⅱ型膠原免疫熒光檢測蛋白聚糖多聚體及Ⅱ型膠原蛋白的分泌情況，實驗組和對照組無明顯差別。

我們利用RNAi技術下調β2M對體外預分化為軟骨細胞的BMSCs的免疫原性進行了初步研究。但是，在體內特定條件下，在BMSCs分化過程中沉默β2M基因的表達對免疫排斥反應的抑制效果還有待進一步研究。

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