FXR通過調節促甲狀腺素胚胎因子減輕Con A誘導的自身免疫性肝炎病變*

連 帆， 王 于， 李家平， 吳錫文， 謝俊聰， 吳澤深， 劉冠琪， 許韓師， 梁柳琴， 楊岫巖， 楊建勇

(中山大學 1附屬第一醫院風濕免疫科， 2附屬第一醫院腫瘤介入科， 3中山醫學院，廣東 廣州 510080)

自身免疫性肝炎是由自身免疫反應介導的慢性進行性肝臟炎癥性疾病，病因未明，但嚴重病例可快速進展為肝硬化和肝衰竭[1-4]。自身免疫性肝炎的可能發病機制是：在遺傳易感性基礎上，機體免疫耐受機制破壞，產生針對肝臟自身抗原的免疫反應，從而破壞肝細胞導致肝臟炎癥壞死。

法尼酯衍生物X受體(farnesoid X receptor，FXR)是激素核受體超家族中的一種膽汁酸受體，主要在肝腸系統等組織器官表達，在膽汁酸代謝及膽固醇代謝中發揮重要作用[5-7]。近年來有研究指出，FXR在自身免疫性疾病中有其獨特的抗炎和調節免疫的作用。

促甲狀腺素胚胎因子(thyrotropin embryonic factor，TEF)是亮氨酸拉鏈 (leucine zipper，bZIP) 轉錄因子家族的成員。最初發現其在胚胎發育時期的腺垂體表達，后發現在小鼠的腦、肺、腎、膀胱和消化道中也表達，而在肝臟中的表達呈晝夜節律性[8-10]。Cavadini等[11]發現肝臟TNF-α表達增加時TEF表達下降，間接提示TEF對于炎癥損傷具有保護作用。

本研究旨在觀察FXR和TEF在伴刀豆球蛋白A(concanavalin A, Con A)誘導的肝炎(Con A-induced hepatitis, CIH)小鼠肝損害中的作用，探討FXR-TEF通路改善自身免疫性肝炎的肝功能和減少炎癥反應的部分可能機制。

材 料 和 方 法

1 實驗分組和動物模型的建立

野生型雄性C57BL/6(5～7 周)小鼠50只購自上海斯萊克公司。動物飼養恒溫于25 ℃環境，自由攝水，12 h交替照明。以Con A(購自Sigma)用無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS)稀釋至濃度2.5g/L，采取尾靜脈注射方式，劑量為20 mg/kg，對照組注射等體積PBS。

FXR的激活方法：野生型雄性C57BL/6(5～7 周)小鼠，隨機分為2組，分別為空白處理組和實驗組，在注射Con A前分別以普通飼料和1%鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid，CDCA)喂養1周。

2 實驗指標檢測

2.1小鼠肝功能檢測 在注射Con A后0 h、4 h、8 h、12 h、16 h和24 h尾靜脈取血，離心收集血漿，檢測肝酶學指標谷丙轉氨酶(alanine transaminase，ALT)和谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)。肝酶檢測在全自動生化儀(Hitachi 7600；Tokyo)上完成。

2.2炎癥細胞因子測定 在注射Con A后0 h、4 h、8 h、12 h、16 h 和24 h取血，離心收集血漿，按照Bio-Plex Suspension Array系統標準流程檢測炎癥細胞因子干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素2(interleukin 2，IL-2)和IL-4。多細胞因子檢測試劑盒及檢測儀器(Bio-Plex 200)均為Bio-Rad產品。嚴格按標準流程來進行實驗并得到結果。板內分析變異系數(coefficient of variation,CV)≤15%，板間分析CV≤25%；標準品及樣本回收率為70%～130%；樣本中目標檢測物線性圖的R2值高于0.95，與標準品曲線的斜率差均≤25%。

2.3qRT-PCR 內參照為β-actin，利用Trizol-氯仿-異丙醇法提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，加入上、下游引物和SYBR預混液等共20 μL(Applied Biosystems)，反應體系在ABI PRISM TM7700 PCR儀進行擴增。引物序列如下：FXR上游引物5’-CCCTGCTTGATGTGCTCAA-3’，下游引物5’-GTGTCCATCACTGCACATCC-3’;TEF上游引物5’-ACCATCTTCCTCTACTGCCATCTTTCAG-3’，下游引物5’-GTACTTGGTCTCGTACTTGGACACGATG-3’；β-actin上游引物5’-CAGCTGAGAGGGAAATCGTG-3’，下游引物5’-CGTGCCAATAGTGATGACC-3’。

2.4Western blotting檢測FXR、TEF蛋白表達的變化 取-80 ℃保存的肝臟組織提取蛋白后，以BCA法測定蛋白濃度，制備上樣蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜后以5%脫脂奶粉封閉1 h，以0.3% TBST洗膜3次，加入FXR和TEF I抗，4 ℃恒溫孵育過夜，再以0.1% TBST洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標記的II抗，在室溫下孵育1 h，洗膜，以ECL化學發光法曝光。內參照為β-actin。

2.5肝臟組織學檢測 小鼠肝臟固定脫水，常規石蠟包埋、切片行HE染色。免疫組織化學檢測：脫蠟后0.3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶活性，微波爐抗原熱修復。10%山羊血清封閉。加入FXR和TEF I抗(Santa Cruz)，4 ℃孵育過夜，PBS洗3次，加入II抗，室溫孵育，PBS洗3次。DAB顯色后，蘇木素復染，脫水、中性樹膠封片。

3 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0 統計軟件分析，兩組比較采用Student’st-test；多組間比較采用One-way ANOVA，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 FXR在Con A誘導的自身免疫性肝炎小鼠中低表達

應用qRT-PCR、Western blotting和免疫組織化學等方法，分別檢測正常對照與Con A誘導的自身免疫性肝炎C57BL/6小鼠肝臟組織中FXR的表達，結果顯示FXR在Con A組小鼠中低表達，見圖1。

Figure 1. FXR expression detected by qRT-PCR (A，n=8), Western blotting (B，n=9), and IHC (C，n=9) in the liver specimens of control (PBS) mice and CIH mice. Mean±SD.*P<0.05 vs PBS.

2 FXR激活對TEF表達的影響

應用qRT-PCR和Western blotting方法，分別監測喂飼正常食物與喂飼1% CDCA的C57BL/6小鼠肝臟組織中TEF的表達，結果顯示喂飼1% CDCA激活FXR 的小鼠，TEF表達上調，顯示出FXR對TEF的正調控作用。在Con A所誘導的CIH小鼠，TEF表達降低，CDCA激活FXR后，TEF表達次上調,見圖2。

3 FXR激活改善Con A小鼠肝功能

C57BL/6小鼠在注射Con A后分別在0 h、4 h、8 h、12 h、16 h和24 h取血，離心收集血漿，檢測肝酶ALT和AST。結果顯示Con A可引起肝損傷，肝酶上升峰值出現在12 h，之后逐漸下降。而注射Con A前喂飼1% CDCA激活FXR的小鼠肝酶上升幅度遠低于喂飼普通食物者，顯示出FXR激活具有改善肝功能的作用,見圖3。

4 FXR激活下調Con A小鼠炎癥因子

在注射Con A后分別在0 h、4 h、8 h、2 h、6 h和24 h取血，離心收集血漿，檢測炎癥細胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-4和IL-2。結果顯示Con A引起炎癥因子分泌增加，注射Con A前喂飼1% CDCA激活FXR的小鼠炎癥因子上升幅度遠小于喂飼普通食物者，顯示出FXR激活能減少小鼠肝臟炎癥反應,見圖4。

討 論

法尼酯衍生物X受體是膽汁酸受體的一種，主要在肝腸系統等組織器官表達，屬于激素核受體超家族的一員，在膽汁酸及膽固醇代謝中發揮重要作用。但FXR的作用遠不止于代謝調節。近期研究發現，FXR還具有抗炎和免疫調節的作用。我們之前的研究也表明，FXR具有減輕SLE肝臟炎癥損傷的作用[12]。

本研究探討了FXR在自身免疫性肝炎中的作用，并對其可能的調控通路進行分析。Con A誘導的肝炎是最接近人類自身免疫性肝炎的動物模型，Con A能迅速誘導肝臟炎癥發生，表現出肝酶升高、T淋巴細胞浸潤、炎癥介質如TNF-α及IFN-γ等均明顯升高。

本研究結果表明FXR在CIH的表達量較正常C57BL/6小鼠明顯下降。這說明FXR在自身免疫性肝炎的發生發展中可能是一個保護性因素。由圖3可見，FXR激活能明顯降低Con A引起的肝酶升高，顯示其對CIH的保護作用。

在CIH中，多種免疫細胞參與炎癥反應，如NK細胞、Kupffer細胞和CD4+T淋巴細胞等，有多種炎癥介質介導引起肝損害，有研究表明，在自身免疫性肝炎小鼠模型的肝臟和脾臟，TNF-α、IL-2、IL-4和IFN-γ表達升高[13-14]。

Figure 2. Effects of FXR activation on the expression of TEF at mRNA (A, C) and protein (B, D) levels in the liver specimens of the C57BL/6 mice with different treatments. A, B: control (PBS) mice with or without 1% CDCA; C, D: CIH (Con A) mice with or without 1% CDCA. Mean±SD. n=9 in A and C; n=10 in B; n=11 in D. *P<0.05 vs PBS; #P<0.05 vs Con A.

Figure 3. Activation of FXR decreased serum levels of ALT (A) and AST (B).Mean±SD. n=12. *P<0.05 vs Con A+CDCA.

Figure 4. Activation of FXR suppressed the inflammatory cytokines in Con A -induced hepatitis (CIH)mice. Serum IFN-γ, TNF-α, IL-4 and IL-2 were measured in the CIH mice and the control (PBS) mice in the presence or absence of CDCA at different time points.Mean±SD n=5. *P<0.05 vs PBS or PBS+CDCA; #P<0.05 vs Con A.

本研究中CIH小鼠體內實驗初步證實，FXR激活可減少炎癥介質的產生。C57BL/6小鼠被喂養1%CDCA 1周后，FXR可被激活，再注射Con A誘導自身免疫性肝炎，炎癥因子檢測結果顯示PBS飼養和CDCA飼養的C57BL/6小鼠中炎癥因子表達不明顯；而由Con A誘導的CIH則出現明顯增高的炎癥因子表達，喂養FXR激活劑CDCA的CIH小鼠炎癥因子明顯降低，但仍比非CIH小鼠要高(圖4)。由此，我們推測，FXR激活能夠緩解CIH炎癥介質介導的肝臟損傷。

為進一步深入探討FXR的作用機制，FXR及其靶基因在調節中可能存在某些聯系，它們可能具有某種相互作用，在自身免疫性肝炎的發病機制中共同起作用。TEF是亮氨酸拉鏈轉錄因子家族的成員。本研究中發現FXR激活明顯促進了TEF的表達。FXR被CDCA激活后，TEF mRNA水平與FXR呈正相關，其蛋白表達也有相應的上調。既往研究也發現FXR具有抑制細胞凋亡的作用[12]，而TEF早已被證實為調控凋亡的重要轉錄因子之一[15]，由此可見FXR-TEF可能通過抑制CIH肝臟細胞過度炎癥凋亡而起保護作用。

綜上所述，本研究提示，FXR在CIH中具有保護肝細胞、減少炎癥因子分泌的作用，激活FXR可能是抑制自身免疫性肝炎的途徑之一，而FXR的保護作用可能是通過TEF來實現的。

[參 考 文 獻]

[1] McFarlane IG. Autoimmune hepatitis: Diagnostic criteria, subclassifications, and clinical features[J]. Clin Liver Dis, 2002, 6(3):605-621.

[2] Manns MP, Strassburg CP. Autoimmune hepatitis: clinical challenges[J]. Gastroenterology, 2001, 120(6):1502-1517.

[3] McFarlane IG. Definition and classification of autoimmune hepatitis[J]. Semin Liver Dis, 2002, 22(4):317-324.

[4] 連 帆，王 于，范文哲，等.經肝動脈同種異體脂肪干細胞移植治療小鼠自身免疫性肝炎的實驗研究[J]. 中國病理生理雜志，2011, 27(7):1389-1392.

[5] Zhu Y, Li F, Guo GL. Tissue-specific function of farnesoid X receptor in liver and intestine[J]. Pharmacol Res, 2011, 63(4):259-265.

[6] 李 鋒，王吉耀. 法呢醇X受體作用的研究進展[J]. 中國病理生理雜志，2008, 24(10):2072-2076.

[7] 連 帆，王 于，李家平，等. 激活FXR抑制MRL/lpr狼瘡小鼠肝損害的研究[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(2):210-213.

[8] Gavriouchkina D, Fischer S, Ivacevic T, et al. Thyrotroph embryonic factor regulates light-induced transcription of repair genes in zebrafish embryonic cells [J]. PLoS One, 2010, 5(9): e12542.

[9] Zhou J, Hoggatt AM, Herring BP. Activation of the smooth muscle-specific telokin gene by thyrotroph embryonic factor (TEF)[J]. J Biol Chem, 2004, 279(16):15929-15937.

[10] Gachon F, Fonjallaz P, Damiola F, et al. The loss of circadian PAR bZip transcription factor results in epilepsy [J]. Genes Dev, 2004, 18(12):1397-1412.

[11] Cavadini G, Petrzilka S, Kohler P, et al. TNF-α suppresses the expression of clock genes by interfering with E-box-mediated transcription[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104(31):12843-12848.

[12] Lian F, Wang Y, Chen J, et al. Activation of farnesoid X receptor attenuates liver injury in systemic lupus erythematosus[J]. Rheumatol Int, 2012, 32(6): 1705-1710.

[13] Cao J, Liu FX, Yu MX. Expression of programmed death 1 and its ligands in the liver of autoimmune hepatitis C57BL/6 mice[J]. Chin Med J (Engl), 2009, 122(16): 1941-1946.

[14] Oikawa T, Takahashi H, Ishikawa T, et al. Intrahepatic expression of the co-stimulatory molecules programmed death-1, and its ligands in autoimmune liver disease[J]. Pathol Int, 2007, 57(8):485-492.

[15] Ritchie A, Gutierrez O, Fernandez-Luna JL. PAR bZIP-bik is a novel transcriptional pathway that mediates oxidative stress-induced apoptosis in fibroblasts [J]. Cell Death Differ, 2009, 16(6):838-846.