慢病毒介導的CCN1基因對大鼠骨髓間充質干細胞生長和遷移的影響*

孫 湛， 鞏雪俐， 冉新建， 馬 琪， 龍 梅△

(新疆醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院 1機能中心實驗室， 2病理生理學教研室，新疆 烏魯木齊 830054)

腦血管疾病(cerebrovascular disease, CVD)是指由于各種腦血管病變所引起的腦部病變，發(fā)病率和致殘率很高，給患者和家庭帶來痛苦和沉重的負擔，其治療關鍵是改善缺血區(qū)的血供，挽救瀕死的神經(jīng)元。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)能夠促進半暗帶血管新生,有效改善半暗帶血供，從而挽救瀕死神經(jīng)元，故已成為治療缺血性腦損傷的研究熱點。慢病毒載體尤其適用于干細胞，具有目的基因可整合到染色體上，穩(wěn)定表達時間較長，不易引發(fā)宿主免疫反應等諸多優(yōu)點。

富半胱氨酸蛋白61(cysteine-rich 61，Cyr61/CCN1)是即刻早期基因編碼的富半胱氨酸蛋白，是近年發(fā)現(xiàn)的一種分泌型基質信號蛋白[1]，能上調多種生長因子的表達，如VEGF及轉化生長因子等；能促進內(nèi)皮細胞黏附、增殖和遷移，調節(jié)血管生成[2]。本研究通過設計并構建出攜帶有含增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)及大鼠CCN1目的基因的慢病毒表達載體，觀察外源性CCN1能否促進BMSCs的生長和遷移，為BMSCs移植治療缺血性腦損傷提供理論基礎。

材 料 和 方 法

1 動物和材料

6～8周齡雄性Wistar大鼠1只，體質量120 g，由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

STBL3感受態(tài)細胞、基因過表達慢病毒載體、慢病毒轉染試劑和293T細胞為輝駿生物公司產(chǎn)品；高純度質粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、總RNA提取試劑盒和Quant一步法RT-PCR試劑盒為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；限制性核酸內(nèi)切酶為Ferentas產(chǎn)品；PrimeScript反轉錄酶、PCR擴增試劑盒和DL2000 DNA marker為大連TaKaRa產(chǎn)品；T4 DNA連接試劑盒為Promega產(chǎn)品；KOD Plus DNA聚合酶為Toyobo產(chǎn)品；低糖DMEM和胎牛血清為Gibco產(chǎn)品；Cyr61/CCN1 Ⅰ抗為Santa Cruz產(chǎn)品；MTT為博士德產(chǎn)品；其余試劑為國產(chǎn)或進口化學純或分析純。

2 方法

2.1載體的構建和鑒定 根據(jù)大鼠CCN1 mRNA序列(NCBI GenBank，基因編號：NM_031327.2)，全基因合成CCN1基因(CDS區(qū)域序列)并基因測序驗證。引物由上海生工合成，上游引物5’-GCGGAATTCTGCGCGCCACAATGAGCTC-3’，劃線部分為EcoR I酶切位點；下游引物5’-GACGGATCCCCTTTAGTCCCTGAACTTGTG-3’，劃線部分為BamH I酶切位點。將全基因合成的CCN1構建至過表達載體CAG-MCS-EF1-copGFP，并轉化至感受態(tài)細胞DH5α，氨芐青霉素篩選培養(yǎng)，平板分別挑取4個克隆，用過表達載體通用引物進行菌落PCR篩選。篩選得到的陽性克隆進行測序，以驗證重組克隆中插入片段序列是否與CDS區(qū)域的基因序列一致。選取符合預期大小擴增片段，送測序驗證。

2.2過表達慢病毒的包裝 取對數(shù)生長期細胞293T細胞，按照6× 106個細胞數(shù)接種于10 cm培養(yǎng)皿中。轉染前2 h將培養(yǎng)基更換為不含雙抗DMEM+10%FBS培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h。將包裝質粒和構建好的慢病毒表達載體在生理鹽水中混合，并加入轉染試劑，孵化20 min后緩慢均勻滴入培養(yǎng)皿中并混勻，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)8 h。倒去含有轉染混合物的培養(yǎng)基，PBS洗滌，更換含有100 mL/L小牛血清的新鮮培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉染48～72 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞發(fā)光(綠色熒光)情況，待確認轉染成功后，反復凍融細胞收集上清液，3 000～4 000 r/min離心15 min，用0.45 μm微孔濾器過濾去除所有的細胞及碎片，濃縮得到高濃度的慢病毒濃縮液，-80 ℃保存。

2.3孔稀釋法測定病毒滴度 滴度測定前1 d，為培養(yǎng)好的293T細胞換液，并將其接種至96孔板中，每孔的細胞數(shù)目約為(0.3～1.0)×104個，培養(yǎng)基體積為100 μL/well。將10 μL病毒上清按梯度稀釋10～106倍，將稀釋好的病毒液100 μL依次加到細胞孔中，繼續(xù)放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后，每孔分別加入新鮮培養(yǎng)基100 μL。96 h后觀察熒光表達情況，數(shù)出最后2個含有熒光細胞的孔中的熒光細胞個數(shù)；病毒原液的滴度值=熒光細胞個數(shù)/稀釋后的病毒量。

2.4大鼠BMSCs分離及培養(yǎng) 采用貼壁篩選法獲取大鼠BMSCs，將Wistar大鼠斷頸處死，無菌條件下剪取四肢骨骼，用低糖DMEM反復沖洗大鼠四肢骨髓腔，將含有骨髓細胞的培養(yǎng)液1 500 r/min離心10 min，棄去上清，用含10%FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基重懸并接種于培養(yǎng)皿中。在37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種培養(yǎng)約24 h后換液，棄去未貼壁細胞。以后隔天換液，連續(xù)3次后改為每周換液2次。每天觀察細胞形態(tài)并作記錄。原代培養(yǎng)的細胞鋪滿整個培養(yǎng)瓶底面約80%時，即可用0.125%胰酶將貼壁細胞消化分離，然后按照1∶2比例傳代接種培養(yǎng)，以此獲得大鼠BMSCs，采用第3代細胞進行實驗。

2.5CCN1慢病毒轉染大鼠BMSCs 將第3代大鼠BMSCs進行胰酶消化，將細胞懸液(細胞數(shù)約為4×105)接種在24孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合度達到約80%后，將Lenti-GFP-CCN1按感染復數(shù)(MOI)=1×106v.g./cell加入DMEM培養(yǎng)基中，同時加入4～8 mg/L polybrene增強轉染。轉染BMSCs 96 h后觀察GFP基因的表達情況。

2.6Western blotting檢測大鼠BMSCs中CCN1蛋白的表達 Lenti-GFP和Lenti-GFP-CCN1感染BMSCs，收集細胞上清液，Lenti-GFP感染細胞為陰性對照，未處理為空白對照，Western blotting法檢測CCN1蛋白表達。BCA法測定樣本的蛋白濃度，制備電泳凝膠，進行SDS-PAGE。電泳結束后進行膜處理、轉膜。5% 脫脂奶粉4 ℃封閉過夜；加入Ⅰ抗4 ℃過夜；PBS洗膜3次，每次10 min；加入辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗(稀釋度1∶6 000)，室溫孵育1 h棄Ⅱ抗，PBS室溫振搖洗膜3次，每次10 min。加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時放入雙蒸水中終止反應。

2.7CCN1對BMSCs生長的影響 采用MTT比色實驗。收集BMSCs細胞，調整細胞數(shù)為1×108/L，按100 μL/well接種于96孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)8 h后加入Lenti-GFP，Lenti-GFP-CNN1感染BMSCs 96 h后，滴加2 g/L MTT(50 μL/well)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液(150 μL/well)，將培養(yǎng)板置于微孔板振蕩器上振蕩10 min，使結晶溶解，在570 nm波長測定吸光度(A)值，每個濃度重復5孔。

2.8劃痕愈合實驗檢測BMSCs遷移 對照孔和實驗孔分別以Lenti-GFP和Lenti-GFP-CNN1感染BMSCs，48 h 后更換為含 0.5%胎牛血清的培養(yǎng)液并做劃痕標記，顯微鏡下記錄不同時點細胞向劃痕遷移情況。按公式計算該劃痕不同時點的愈合速率。愈合速率(%)=(初始劃痕寬度值-相應點劃痕寬度值) /初始劃痕寬度值×100%。

3 統(tǒng)計學處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 CCN1基因克隆PCR產(chǎn)物凝膠電泳結果

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，基因片段的大小為1 140 bp，與預期一致，見圖1。

Figure 1. Amplification of the gene fragment of CCN1 by PCR.M: DNA marker; 1: CCN1 PCR product.

2 CCN1慢病毒轉染BMSCs

Lenti-GFP-CCN1轉染BMSCs，在倒置熒光顯微鏡下觀察,染24 h時可以觀察到部分綠色熒光，轉染96 h時，GFP表達明顯增加，見圖2。

Figure 2. The cell transfected efficiency at different time points (×100). A: 24 h; B: 48 h; C: 96 h.

3 Lenti-GFP-CCN1轉染BMSCs

Lenti-GFP和Lenti-GFP-CCN1轉染BMSCs，收集細胞上清液，Lenti-GFP轉染細胞為陰性對照，未處理為空白對照，Western blotting法檢測表明CCN1成功重組到慢病毒中，見圖3。

Figure 3. Expression of CCN1 in BMSCs transfected with Lenti-GFP-CCN1.Lane 1: non-transfection group; Lane 2: negative control group (transfected with Lenti-GFP); Lane 3: transfection group (transfected with Lenti-GFP-CCN1).

4 CCN1對BMSCs細胞存活率的影響

MTT比色結果顯示，Lenti-GFP-CCN1轉染BMSCs后4 d，細胞存活率較空白組及Lenti-GFP組增加，但差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖4，表明CCN1對正常細胞存活率沒有顯著影響。

Figure 4. Effect of CCN1 on proliferation of BMSCs.Mean±SD.n=5.

5 CCN1對細胞遷移能力的影響

劃痕損傷4 d后，與空白組及Lenti-GFP 組細胞相比，Lenti-GFP-CCN1轉染組的細胞更趨于愈合，CCN1明顯增強了BMSCs的遷移能力，見表1。

表1 CCN1對大鼠BMSCs細胞劃痕愈合程度的影響

討 論

腦血管病是發(fā)病率和致殘率很高的疾病,其治療關鍵是改善缺血區(qū)的血供，挽救瀕死的神經(jīng)元。干細胞能夠促進半暗帶血管新生,有效改善半暗帶血供，從而挽救瀕死神經(jīng)元，故已成為治療缺血性腦損傷的研究熱點[3-5]。然而，缺血損傷區(qū)大量的氧自由基能明顯抑制BMSCs與損傷區(qū)的血管內(nèi)皮細胞及細胞外基質的黏附，導致BMSCs“失巢性凋亡”并限制其促進血管新生的作用[6]。失巢凋亡是由于細胞與細胞外基質和其它細胞失去接觸而誘導的一種程序化死亡形式，發(fā)生在BMSCs在移植到缺血半暗帶的起始階段。因此，只有能夠與細胞外基質黏附，具有抗失巢凋亡能力的BMSCs才能在脈管系統(tǒng)中生存下來，才能發(fā)揮治療作用。

Cyr61/CCN1是即刻早期基因編碼的富半胱氨酸蛋白，它與細胞表面和細胞外基質有關，是一種基質相關蛋白，可與肝素和多種細胞整合素相互作用，受多種因素調節(jié)，如生長因子、 激素、 藥物等。可介導細胞信號轉導、 細胞黏附、 遷移和趨向性，促進細胞存活和血管形成。基質信號蛋白CCN1可能在調控內(nèi)皮祖細胞增殖、分化，參與血管發(fā)生中扮演重要角色。在成體血管組織中，CCN1幾乎在所有血管細胞包括內(nèi)皮、平滑肌和纖維細胞等都有表達，誘導內(nèi)皮細胞的增殖和遷移是CCN1促進血管生成的直接作用[7-8]。

慢病毒載體是在人Ⅰ型免疫缺陷病毒基礎上，對其特異性基因骨架進行改造而形成的。慢病毒載體能利用自身逆轉錄酶和整合酶將自身RNA轉錄為cDNA整合到宿主細胞染色體中，使其有效表達外源基因，是當前基因治療中載體研究的熱點之一，對分裂細胞核非分裂細胞均具有感染能力，能在體內(nèi)長時間穩(wěn)定表達，安全性好[9]。本研究中我們構建帶有綠色熒光蛋白的重組慢病毒Lenti-GFP-CCN1，通過倒置熒光顯微鏡觀察，重組慢病毒隨著感染BMSCs時間的延長，其感染效率也會隨之增高，96 h時達到最高。分別用重組慢病毒Lenti-GFP-CCN1和Lenti-GFP感染細胞，應用MTT比色法檢測吸光度值，各組間吸光度值未見顯著差異，表明外源性CCN1對正常細胞的存活率沒有明顯影響。另外，我們通過劃痕愈合實驗證實外源性的CCN1可以促進大鼠BMSCs細胞劃痕的愈合。綜上分析，CCN1修飾BMSCs后可以促進BMSCs的生長與遷移，為外源性CCN1促進BMSCs的遷移作用及其機制研究奠定了基礎，并可望為缺血性腦病的基因治療奠定基礎。

[參 考 文 獻]

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