冬凌草甲素對人肺癌NCI-H460細胞侵襲和遷移的影響*

柳悄然， 張在云， 于曉明， 潘祥林， 王涓冬， 劉軍莉

(1山東大學醫學院，山東 濟南 250012；山東大學第二醫院 2腫瘤防治中心， 3臨床分子實驗室，山東 濟南 250033)

肺癌嚴重危害人類健康，發病率及死亡率高，目前的治療方法副作用大，效果不理想，需要探索高效低毒的藥物。冬凌草甲素是從冬凌草中提取的一種四環二萜類化合物，具有抗炎、抗菌、降壓、抗腫瘤等多種藥理作用[1-2]。研究顯示，冬凌草甲素通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制血管生成等多種機制發揮抗腫瘤作用[3]，但關于冬凌草甲素對肺癌細胞的侵襲和遷移的作用研究較少，本文就此進行研究，以進一步揭示冬凌草甲素抗腫瘤作用機制，為肺癌治療探索有效的方法。

材 料 和 方 法

1 儀器及材料

CO2培養箱(Format)；恒溫離心機(Heraeus)；酶標儀(Bio-Rad)，垂直電泳裝置(Bio-Rad)。NCI-H460細胞購自中國科學院細胞研究所；冬凌草甲素購自上海詩丹德生物技術有限公司(純度≥98%)；RPMI-1640購自Gibco；MTT及二甲基亞砜購自Sigma；兔抗鼠IgG抗體、鼠抗人β-actin、基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)和MMP-9抗體購自Santa Cruz；細胞培養板購自Corning；Boyden Chamber購自Millipore；Western-blot Luminol(ECL)試劑盒購自Santa Cruz。

2 方法

2.1NCI-H460細胞的生長觀察 NCI-H460肺癌細胞株在37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。胰酶消化，將細胞接種于12孔培養板，每孔1×105細胞，分為高劑量(high-dose,HD)組、中劑量(middle-dose,MD)組、低劑量(low-dose,LD)組和對照(normal,N)組，前3組為實驗組，分別用含40、20和10 μmol/L冬凌草甲素的RPMI-1640細胞液培養，N組用不含冬凌草甲素的RPMI-1640液培養，連續培養7 d。每24 h每組取3孔細胞，用胰酶消化，用0.2%臺盼藍染色，以血球計數板計數，實驗重復3次，以每組細胞數的平均值繪制生長曲線。

2.2NCI-H460細胞增殖檢測 將4組NCI-H460細胞用胰酶消化，稀釋細胞為1×107/L，接種于96孔培養板，每組3復孔，每孔1×103細胞，終體積200 μL，37 ℃培養24 h、48 h及72 h后，加入MTT 100 μg/well，培養4 h，離心，棄上清，加入DMSO振蕩10 min，用酶標儀于570 nm測吸光度(A)。重復實驗3次。計算細胞增殖抑制率：細胞增殖抑制率(%)=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100%。

2.3NCI-H460細胞的侵襲實驗 將4組NCI-H460細胞干預培養24 h，胰酶消化，制成單細胞懸液，進行Boyden chamber侵襲試驗，檢測細胞的侵襲能力。下室加含10%胎牛血清的培養基，上室內接種2×105細胞，每組設3個復孔。培養72 h后計數穿透濾膜的細胞數，表示腫瘤細胞的侵襲能力。倒置顯微鏡下每孔隨機選擇5個200倍顯微鏡視野，統計視野中的細胞總數，計算3復孔的平均值，實驗重復3次。

2.4劃痕實驗檢測NCI-H460細胞的遷移能力 將4組處于對數生長期的NCI-H460細胞用胰酶消化，用PBS洗2遍，重懸細胞，稀釋細胞濃度為2×108/L，按每孔1 mL接種于24孔細胞培養板，每組6復孔，接種后24 h，用200 μL移液槍頭在培養板底部做“一”字形劃痕，沿劃痕邊緣等間距做3個標記作為觀察點，用PBS洗去劃落的細胞，繼續培養48 h，倒置顯微鏡下測量細胞遷移的距離，計算細胞遷移的平均速率。計數每孔劃痕處3個視野的遷移細胞數，進行統計分析。

2.5Western blotting檢測MMP-2和MMP-9的表達 用胰酶消化收集4組細胞，將每組細胞1×106個裂解，提取蛋白,并測定蛋白濃度；進行SDS-PAGE，將蛋白電轉移至硝酸纖維素膜，室溫封閉1 h，加入鼠抗人β-actin、MMP-2和MMP-9抗體，再加入辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG抗體，進行ECL反應顯影并曝光，在Bio-Rad凝膠成像儀中觀察，實驗重復3次。用Quality One軟件分析條帶相對A值(靶蛋白A/β-actinA)，比較蛋白表達水平。

3 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，用SPSS 17.0軟件分析。多組資料間的比較用方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 NCI-H460細胞生長情況

倒置顯微鏡下觀察細胞外形，與N組比較，用冬凌草甲素干預的NCI-H460細胞變圓，貼壁延緩，伸展差，懸浮細胞增多，細胞密度降低，HD組變化更明顯。細胞計數顯示，4組細胞數量間有顯著差異，HD組

Figure 1. Growth curves of NCI-H460 lung cancer cells cultured with 40, 20 and 10 μmol/L of oridonin (HD, MD and LD groups), or without oridonin (N group). Mean±SD. n=3.

2 MTT方法檢測NCI-H460細胞增殖

4組細胞在48 h(P<0.01)及72 h(P<0.01)時測定A值均有顯著差異，與N組相比，實驗組A值均降低，HD組

Figure 2. The cell proliferation in experimental groups (HD, MD and LD) and N group was determined by MTT assay.Mean±SD.n=3. **P<0.01 vs experimental groups.

3 NCI-H460細胞的侵襲能力

細胞體外侵襲實驗顯示，4組細胞穿透濾膜的細胞數均有顯著差異(P<0.01)，與N組(53.67±6.68)相比，HD組(26.67±5.16)、MD組(36.17±5.08)和LD組(44.33±5.50)穿透細胞數明顯減少，表明經冬凌草甲素處理的NCI-H460細胞侵襲能力減弱。

4 NCI-H460細胞的遷移能力

將4組NCI-H460細胞做劃痕實驗，計算細胞遷移的平均速率及遷移細胞數。結果4組細胞的平均遷移速率(P<0.01)及遷移細胞數(P<0.01)有顯著差異，見表1，N組均高于實驗組，在實驗組中，HD組平均遷移速率及遷移細胞數最低。

表1 NCI-H460細胞的遷移能力

5 Western blotting方法檢測NCI-H460細胞的MMP-2和MMP-9的表達

結果顯示，4組細胞均有MMP-2及MMP-9蛋白表達；以靶蛋白A/β-actinA的比值代表蛋白相對表達水平，N組表達MMP-2(1.16±0.26)及MMP-9(0.90±0.14)均高于實驗組(P<0.01)，HD組表達MMP-2(0.29±0.09)及MMP-9(0.31±0.06)水平最低，HD組

討 論

肺癌的發病率和死亡率在全世界范圍內持續升高，已成為惡性腫瘤死因的第一位，而大部分肺癌患者死于腫瘤的復發和轉移，探索有效的抑制腫瘤侵襲轉移的藥物具有重要意義。

冬凌草甲素是從唇形科香茶菜屬植物冬凌草中提取的二萜類化合物，具有明顯的抗腫瘤作用，是中草藥冬凌草抗腫瘤的主要活性成分，對胃癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、食管癌、鼻咽癌和結直腸癌等多種腫瘤細胞具有抑制作用[4-6]。體外研究顯示，冬凌草甲素可抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡，抑制核因子κB、絲裂原活化蛋白激酶、表皮生長因子受體等相關信號通路防止腫瘤發生，增強吞噬細胞吞噬作用等[7-8]，冬凌草甲素還可阻遏細胞周期、下調端粒酶活性、抑制細胞膜鈉泵活性、逆轉多藥耐藥等[9-11]。關于冬凌草甲素對肺癌細胞作用，研究顯示它能抑制SPC-A-1細胞增殖，誘導SPC-A-1細胞凋亡，增強A549肺癌細胞的自吞噬作用[12]。但關于冬凌草甲素對肺癌細胞的侵襲和遷移能力的影響鮮有報道。

Figure 3. The protein expression of MMP-2 and MMP-9 was determined by Western blotting. Mean±SD.n=3. **P<0.01 vs other groups.

在本項目中，用冬凌草甲素干預處理NCI-H460細胞，進行體外增殖、侵襲、遷移能力觀察，結果經冬凌草甲素干預處理的細胞生長減慢，實驗組細胞數量明顯低于N組，且與冬凌草甲素劑量明顯相關，HD組

侵襲和轉移是腫瘤惡性程度的重要標志，也是導致肺癌患者死亡的主要原因。細胞外基質是惡性腫瘤侵襲、轉移的重要組織屏障，MMP能降解細胞外基質中的各種蛋白成分，在惡性腫瘤的侵襲轉移中發揮關鍵作用。其中MMP-2和MMP-9是最主要的Ⅳ型膠原酶，已證實MMP-2和MMP-9在多種腫瘤中表達，并與腫瘤細胞的侵襲、轉移能力密切相關，抑制MMP-2和MMP-9的表達及活性，能抑制腫瘤的侵襲、轉移[13]。在本實驗中，經冬凌草甲素干預處理的NCI-H460肺癌細胞MMP-2和MMP-9表達下調，且與冬凌草甲素劑量相關，HD組最明顯，與NCI-H460細胞的侵襲、遷移實驗結果一致，表明冬凌草甲素可通過下調MMP-2和MMP-9抑制NCI-H460肺癌細胞的侵襲、遷移。

本課題通過體外研究，表明冬凌草甲素能抑制NCI-H460肺癌細胞增殖、侵襲和遷移能力，并抑制NCI-H460肺癌細胞表達MMP-2和MMP-9，為冬凌草甲素用于肺癌治療奠定了基礎。

[參 考 文 獻]

[1] Ku CM, Lin JY. Anti-inflammatory effects of 27 selected terpenoid compounds tested through modulating Th1/Th2 cytokine secretion profiles using murine primary splenocytes[J]. Food Chem, 2013, 141(2):1104-1113.

[2] 車憲平，韓瑞發，肖進逐，等. 冬凌草甲素和冬凌草多糖膀胱灌注治療C57BL/6小鼠膀胱腫瘤的療效及機制[J]. 中國病理生理雜志, 2010, 26(7):1410-1412.

[3] Sun KW, Ma YY, Guan TP, et al. Oridonin induces apoptosis in gastric cancer through Apaf-1, cytochrome c and caspase-3 signaling pathway[J]. World J Gastroenterol, 2012, 18(48):7166-7174.

[4] Bu HQ, Luo J, Chen H, et al. Oridonin enhances antitumor activity of gemcitabine in pancreatic cancer through MAPK-p38 signaling pathway[J]. Int J Oncol, 2012, 41(3):949-958.

[5] Wang S, Zhong Z, Wan J, et al. Oridonin induces apoptosis, inhibits migration and invasion on highly-metastatic human breast cancer cells[J]. Am J Chin Med, 2013, 41(1):177-196.

[6] Gao FH, Liu F, Wei W, et al. Oridonin induces apoptosis and senescence by increasing hydrogen peroxide and glutathione depletion in colorectal cancer cells[J]. Int J Mol Med, 2012, 29(4):649-655.

[7] Huang HL, Weng HY, Wang LQ, et al. Triggering Fbw7-mediated proteasomal degradation of c-Myc by oridonin induces cell growth inhibition and apoptosis[J]. Mol Cancer Ther, 2012, 11(5):1155-1165.

[8] Liu Y, Shi QF, Qi M, et al. Interruption of hepatocyte growth factor signaling augmented oridonin-induced death in human non-small cell lung cancer A549 cells via c-Met-nuclear factor-κB cyclooxygenase-2 and c-Met-Bcl-2-caspase-3 pathways[J]. Biol Pharm Bull, 2012, 35(7):1150-1158.

[9] Li CY, Wang EQ, Cheng Y, et al. Oridonin: An active diterpenoid targeting cell cycle arrest, apoptotic and autophagic pathways for cancer therapeutics[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2011, 43(5):701-704.

[10] Wang H, Ye Y, Chui JH, et al. Oridonin induces G2/M cell cycle arrest and apoptosis through MAPK and p53 signaling pathways in HepG2 cells[J]. Oncol Rep, 2010, 24(3):647-651.

[11] 王漢楚，沙麗曉，陳小燕，等. 冬凌草甲素對卵巢癌細胞紫杉醇耐藥性的拮抗作用及其機制研究[J]. 中草藥, 2012, 43(3):534-539.

[12] Liu Y, Liu JH, Chai K, et al. Inhibition of c-Met promoted apoptosis, autophagy and loss of the mitochondrial transmembrane potential in oridonin-induced A549 lung cancer cells[J]. J Pharm Pharmacol, 2013, 65(11):1622-1642.

[13] 劉 倩，王 瑩. MMP-2、MMP-9與肺癌發生、轉移的現狀及進展[J]. 國際呼吸雜志, 2013, 33(4):279-282.