大豆孢囊線蟲不同寄主種群的形態變異及對大豆寄主的適應性差異分析

王慧敏， 趙洪海*， 王鳳龍

(1.青島農業大學農學與植物保護學院，山東植物病蟲害綜合防控重點實驗室，青島 266109;2.中國農業科學院煙草研究所，青島 266101)

大豆孢囊線蟲不同寄主種群的形態變異及對大豆寄主的適應性差異分析

王慧敏1， 趙洪海1*， 王鳳龍2

(1.青島農業大學農學與植物保護學院，山東植物病蟲害綜合防控重點實驗室，青島 266109;2.中國農業科學院煙草研究所，青島 266101)

在對大豆、煙草與地黃寄主上14 個大豆孢囊線蟲(SCN)種群形態與分子鑒定的基礎上，對雌蟲的孢囊和陰門錐進行形態觀察和測計。結果表明：煙草SCN和大豆SCN的各測量值之間無明顯差異(P>0.05)，地黃SCN的陰門窗長(43.8 μm)和寬(33.9 μm)顯著小于其他兩者(P<0.05)；同一寄主不同SCN種群之間的形態也存在一定差異；陰門裂長和下橋長具有穩定性，可以作為鑒定大豆孢囊線蟲可靠的形態特征。3 種寄主種群侵染大豆(‘荷豆12號’)的試驗表明，大豆SCN能侵染大豆并能形成雌蟲，而煙草SCN和地黃SCN未能侵染大豆和形成雌蟲。本研究結果表明SCN不同寄主種群存在形態變異，而它們對大豆的寄主適應性也不相同。

大豆孢囊線蟲； 形態變異； 分子鑒定； 寄主適應性

大豆孢囊線蟲(HeteroderaglycinesIchinohe)(soybean cyst nematode, 簡稱SCN)是一種雌雄異形、兩性生殖的定居性內寄生線蟲，1899 年首次在我國東北地區被發現，目前已遍布黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古、河北、河南、山東、山西、陜西、安徽、北京、江蘇、湖北、上海、浙江等15 個省(直轄市、自治區)[1-2]。大豆孢囊線蟲病是世界上危害大豆最重要的毀滅性病害之一[3]。

SCN的寄主范圍較窄，主要寄生在豆科植物上，如大豆、大果田菁、胡枝子、綠豆、赤豆和菜豆等[4]。此外，該線蟲也可寄生在非豆科植物上，如玄參科的地黃、黃花毛蕊花和比利牛斯金魚草，唇形科的高黃芩，雜草類的寶蓋草和薺菜等[5]。在我國，已報道的寄主植物除豆科植物外，還有地黃[6]、芝麻[7]、泡桐[8]和煙草[9]。線蟲的形態在種內會存在一定的差異，這種差異可能是由遺傳差異、寄主因素、地理起源等多種因素造成[10-12]。對于SCN，不同地理種群間的形態變異已有報道[13-14]，但是有關寄主植物影響形態變異的研究未見報道。此外，SCN可表現出不同的寄主適應性，如菜豆品系‘G122’對美國田納西州大豆上SCN的3 號生理小種高感，卻對同樣來自田納西州大豆上SCN的5號和14 號生理小種表現出抗性[15]。

為了確定寄主對大豆孢囊線蟲的形態分化及適應性的影響，筆者從煙草、大豆、地黃3 種寄主上分離到14 個大豆孢囊線蟲種群(下文簡稱煙草SCN，大豆SCN和地黃SCN)，對其形態變異和寄主適應性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 線蟲的采集

于2013 年在中國3 省8 市共采集14 份SCN土壤樣品，具體采集地點、寄主及編號見表1。采用對角線5 點取樣法，在種有寄主植物的地塊上選定5 個點，用鐵鍬鏟去較干燥的3～5 cm表層土，每個點挖取根及根圍土壤500 g作為一個小樣，將5 個點采集到的小樣混合作為1 份土壤樣品。

表1 不同寄主的孢囊線蟲種群樣品Table 1 The samples of cyst nematode populations on different host plants

1.2 基于形態學與rDNA-ITS基因的物種鑒定

利用直接過篩法分離土中的孢囊，在解剖鏡下挑取飽滿的孢囊放在-4 ℃冰箱內冷藏備用。切取孢囊的陰門錐部分制成玻片，直接過篩法及孢囊陰門錐的制備參照劉維志的方法[16]。

單個孢囊線蟲DNA的提取參考Ou等的方法[17]，PCR擴增引物采用ITS通用引物，AB28(5′-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′)和TW81(5′-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3′)[18]。采用50 μL的反應體系，配比如下：10×PCR buffer(含Mg2+)5 μL，dNTP 1 μL，AB28(10 μmol/L)3 μL， TW81(10 μmol/L)3 μL，TaqDNA多聚酶0.5 μL，模板DNA 3 μL，最后加入ddH2O補足至50 μL。擴增條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35 個循環；最后72 ℃延伸10 min，在4 ℃下保存。取7 μL PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，用EB染色，在紫外燈下成像檢測。選取有條帶的PCR產物送至上海生工進行雙向測序，測序結果與GenBank中收錄的序列進行BLAST比對(登錄號為KJ161289～KJ161302)。從GenBank中下載不同SCN種群的ITS序列并篩選出所有單倍型，以印度和敘利亞的小麥孢囊線蟲(H.avenae)和意大利的煙草球孢囊線蟲(Globoderatabacum)為外群(表2)，采用neighbor-joining(NJ)法(MEGA5.0)構建系統發育樹，系統發育樹各分支的置信度(bootstrap)均進行1 000 次重復檢驗。

表2 GenBank 數據庫下載的SCN的ITS參考序列Table 2 Reference ITS sequences of SCNdownloaded from GenBank database

1.3 形態差異分析

在光學顯微鏡下觀察孢囊陰門錐的形態特征并拍照，對孢囊線蟲的重要分類特征進行測量，包括孢囊的長與寬、陰門裂長、陰門窗長、陰門窗寬、下橋長。每個種群孢囊測量數量見表1，每個孢囊重復測量3次，記平均值。對測量的原始數據，用Excel 2003軟件計算各組數據的平均數、標準差和標準誤。用SPSS 19軟件的One-way ANOVA程序的LSD多重比較法對SCN不同寄主種群間及同一寄主種群間的形態進行差異顯著性分析，顯著水平為0.05。

1.4 三種寄主種群對大豆寄主適應性測定

在直徑為8 cm的盆栽容器中放入260 g土(50%滅菌土壤+50%滅菌沙子)，每個容器中撒入2 粒大豆種子(‘荷豆12 號’)，將容器放在28 ℃[19](L∥D=16 h∥8 h)的溫室中，大約1 周后，待大豆種子長成幼苗后，每盆留取1 株健康的大豆苗，并且保證所有供試的大豆苗長勢相同，然后開始準備接種卵。將孢囊破裂后收集卵，制成卵懸浮液。向大豆苗盆中分別接種采集自大豆XS種群、煙草XT種群和地黃CR種群的線蟲卵，在盆內靠近大豆苗的四周挖出深4 cm的小孔，將卵懸浮液倒入4 個孔內，每盆接種2 000 粒卵，試驗重復3 次[20]。接種30 d后，將大豆連根拔出，采用過篩法和過篩-貝曼漏斗法分離并測定整盆土壤中的孢囊數目和2齡幼蟲(J2)數量；采用次氯酸鈉-酸性品紅染色法檢測大豆根系受侵染情況[16]。

2 結果

2.1 物種形態鑒定與分子鑒定

對采自煙草、大豆和地黃上的14 個供試群體的孢囊進行觀察，發現其主要形態特征與大豆孢囊線蟲完全一致，所有群體的孢囊都為檸檬形，深褐色；有明顯的頸和突出的陰門錐，陰門錐附近有較多排列不規則的泡狀突，下橋發達，膜孔為雙半膜孔結構；每個孢囊內有大約100～200 個卵。通過形態學觀察和形態測量值的比較，將3 種寄主上的14 個供試群體的孢囊線蟲鑒定為大豆孢囊線蟲(HeteroderaglycinesIchinohe，1952)。

電泳結果顯示，14 個供試群體的SCN均能擴增出1 條約1 000 bp的條帶。測序、比對后構建的系統發育樹(圖1)顯示，14 個供試種群的特異性片段與來自美國、加拿大、伊朗及我國云南、甘肅、寧夏、山東、安徽、河南、河北和內蒙古SCN種群聚在一個分支上(遺傳距離 ≤ 0.03)，置信度達到99%；與來自印度的H.avenae種群(KC152906)和敘利亞的H.avenae種群(JX024198)的親緣關系較遠(遺傳距離為0.24～0.44)，而煙草上常見的球孢囊屬線蟲G.tabacum(HQ260403)則處于另一進化分支。

圖1 用NJ法構建的大豆孢囊線蟲及其近緣種的rDNA-ITS序列系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of H. glycines and the closely related species based on rDNA-ITS sequences using NJ method

2.2 SCN不同寄主種群間形態差異

從形態測量值的統計分析來看(表3)，煙草SCN和大豆SCN在孢囊形態上無顯著性差異；地黃SCN在體長、體寬、陰門裂長和下橋長4 個測量值上與大豆SCN和煙草SCN無顯著性差異，在陰門窗長(43.8 μm)和陰門窗寬(33.9 μm)上顯著小于大豆SCN(分別為49.4 μm和35.7 μm)和煙草SCN(分別為47.4 μm和35.6 μm)(P< 0.05)。

2.3 SCN同一寄主不同種群間形態差異

從表4中可看出，煙草SCN LT種群體寬(429.2 μm)最大，陰門窗長(38.0 μm)和陰門窗寬(30.9 μm)最小，與其他3個同寄主種群XT、GT和ZT存在顯著性差異(P< 0.05)。

大豆SCN的QS種群體長(554.7 μm)最小，與其他大豆種群差異顯著(P< 0.05)；種群SS的體寬(425.2 μm)最大，只與種群XS無顯著性差異；種群DS和QS體寬最小(分別為361.7和364.1 μm)，與種群SS和XS差異顯著(P< 0.05)；種群XS和DS的陰門窗長(分別為43.1和44.2 μm)顯著小于其他寄主種群(P< 0.05)；種群SS、XS和DS的陰門窗寬(分別為33.8、33.7和33.3 μm)顯著小于其他寄主種群(P< 0.05)。

地黃SCN的HR、CR 2個種群在孢囊形態上無顯著差異；種群MR與HR和CR種群存在顯著性差異(P< 0.05)，其中體長(614.7 μm)和陰門窗長(35.6 μm)均大于其他兩者。

2.4 三種寄主種群的SCN侵染大豆后的生長發育情況

接種30 d后發現，所有大豆盆土中均有孵出的2齡幼蟲，但大豆SCN種群孵出的2齡幼蟲數量(1 268.7條/盆)遠遠高于煙草SCN和地黃SCN(分別為772.7 條/盆和109.7 條/盆)(P< 0.05)；在所有接種SCN的盆土中均未發現成熟孢囊。大豆根系內線蟲染色檢查發現，在接種大豆SCN的大豆根內有J2(6.4 條/株根)和雌蟲(1.3 個/株根)，而在接種煙草SCN和地黃SCN的大豆根內未發現SCN的任何蟲態(圖2)。

圖2 三種寄主SCN種群接種大豆后的表現Fig.2 Performance of the three host SCN populations after inoculation

3 結論與討論

陳金堂等[6]與程子超等[9]分別首次報道地黃和煙草上的孢囊線蟲為SCN。本研究通過形態學鑒定與rDNA-ITS序列分析，將采自煙草、大豆和地黃上的14 個孢囊種群鑒定為SCN。將本次形態測量數據與前人的測量數據進行比較，發現大豆SCN的陰門窗長，煙草SCN的體長和體寬，地黃SCN的體長、體寬、陰門裂長和陰門窗長比前人的測量數據偏小。究其原因，可能與其寄主種類、營養狀況和生存環境等有關。

表3 不同寄主上的大豆孢囊線蟲形態測量值1)Table 3 Morphological measurements of H. glycines from different hosts

1) 不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。
Different small letters indicated significant difference among different treatments at 0.05 level. The same below.

表4 不同地理群體的大豆孢囊線蟲的形態測量值Table 4 Morphological measurements of different geographical SCN populations

對3種不同寄主上的大豆孢囊線蟲的6個形態指標進行測量和統計分析，結果表明煙草SCN和大豆SCN各測量值之間無明顯差異，而地黃SCN陰門窗長和陰門窗寬顯著小于其他兩者，說明寄主對大豆孢囊線蟲形態分化存在一定的影響。同一寄主不同大豆孢囊線蟲種群之間的形態值也存在著一定的差異，說明了大豆孢囊線蟲形態的多樣性和不穩定性。14個不同群體之間的陰門裂長和下橋長無顯著性差異，可以將兩者作為鑒定大豆孢囊線蟲的穩定和可靠的形態特征。

3種寄主種群侵染大豆的試驗表明，大豆SCN的2齡幼蟲能侵染大豆并較好地在大豆上繁殖，而煙草SCN和地黃SCN雖然能在大豆苗土中孵化出2齡幼蟲，但是數量較少，且不能侵染大豆根部和形成雌蟲，說明寄主轉換后新寄主對SCN的孵化和侵入產生抑制作用，SCN對新寄主的適應能力不強。對于此結果有2種原因可以解釋，一是適宜寄主植物的根系分泌物對SCN卵的孵化刺激較大，非適宜寄主植物對SCN卵的孵化刺激較小[21]，因而大豆SCN能在大豆上產生較多的2齡幼蟲進而更容易有機會侵染大豆，而地黃和煙草SCN孵出2齡幼蟲數量較少，侵入根系的機會減少；二是煙草SCN和地黃SCN對大豆無致病性，原來發生在大豆上的SCN在對煙草和地黃的適應過程中致病基因發生某種改變，但是這種改變如何變化還不得而知。

[1]許艷麗，王麗芳，戰麗莉．大豆胞囊線蟲病研究進展(續一)[J]．大豆科技，2010(1)：21-24．

[2]Zheng J，Zhang Y，Li X，et al．First report of the soybean cyst nematode，Heteroderaglycines，on soybean in Zhejiang，eastern China[J]．Plant Disease，2009，93(3)：319．

[3]Li X X，Wu H Y，Shi L B，et al．Comparative studies on some physiological and biochemical characters in white and brown cysts ofHeteroderaglycinesrace 4[J]．Nematology，2009，11(3)：465-470．

[4]Heydari R，Pourjam E，Maafi Z T，et al．Comparative host suitability of common bean cultivars to the soybean cyst nematode，Heteroderaglycines，in Iran[J]．Nematology，2010，12(3)：335-341．

[5]Venkatesh R，Harrison S K，Riedel R M．Weed hosts of soybean cyst nematode(Heteroderaglycines)in Ohio[J]．Weed Technology，2000，14(1)：156-160．

[6]陳金堂，李知．為害地黃的大豆孢囊線蟲的初步研究[J]．植物病理學報，1981，11(1)：37-44．

[7]山西省大豆孢囊線蟲病調查協作組．大豆孢囊線蟲病在山西省的發生分布、為害程度和寄主范圍[J]．華北農學報，1987，2(3)：74-79．

[8]張東升．大豆胞囊線蟲侵染泡桐和豌豆的研究[J]．植物病理學報，1995，25(3)：275-278．

[9]程子超，趙洪海，李建立，等．山東省寄生煙草的孢囊線蟲種類鑒定及種內群體間rDNA-ITS-RFLP分析[J]．植物病理學報，2012，42(4)：387-395．

[10]黃健，戚龍君，王金成，等．腐爛莖線蟲種內不同群體形態及遺傳分析[J]．植物病理學報，2009，39(2)：125-131．

[11]Ye W，Robbins R T．Morphological observation onLongidoruscrassusThorne，1974(Nematoda:Longidoridae)and its intraspecies variation[J]．Journal of Nematology，2005，37(1)：83-93．

[12]Stock S P，Mracek Z，Webster J M．Morphological variation between allopatric populations ofSteinernemakraussei(Steiner，1923)(Rhabditida：Steinernematidae)[J]．Nematology，2000，2(2)：143-152．

[13]Faghihi J，Ferris J M，Ferris V R．Heteroderaglycinesin Indiana：II．Morphology of geographical isolates[J]．Journal of Nematology，1986，18(2)：173-177．

[14]Lax P，Doucet M E．HeteroderaglycinesIchinohe，1952(Nematoda：Tylenchida)from Argentina．4．Morphological and morphometrical characterisation of cysts[J]．Nematology，2002，4(7)：783-789．

[15]Smith J R，Young L D．Host suitability of diverse lines ofPhaseolusvulgaristo multiple populations ofHeteroderaglycines[J]．Journal of Nematology，2003，35(1)：23-28．

[16]劉維志．中國檢疫性植物線蟲[M]．北京：中國農業科學技術出版社，2004：72-117．

[17]Ou S，Peng D，Liu X，Li Y，et al．Identification ofHeteroderaglycinesusing PCR with sequence characterised amplified region(SCAR)primers[J]．Nematology，2008，10(3)：397-403．

[18]Zheng J，Subbotin S A，Waeyenberge L，et al．Molecular characterisation of ChineseHeteroderaglycinesandH.avenaepopulations based on RFLPs and sequences of rDNA-ITS regions[J]．Russian Journal of Nematology，2000，8(2)：109-113．

[19]趙洪海，程子超，王鳳龍．山東省煙草孢囊線蟲的群體動態和世代發生特點[J]．植物保護學報，2013，40(6)：529-532．

[20]Masler E P，Rogers S T．Effects of cyst components and low temperature exposure ofHeteroderaglycineseggs on juvenile hatchinginvitro[J]．Nematology，2011，13(7)：837-844．

[21]吳海燕，段玉璽，李秀俠，等．SCN侵染對不同大豆品種根系氨基酸/低分子肽類分泌物的影響[J]．植物病理學報，2007，37(6)：616-622.

MorphologicalvariationofHeteroderaglycinesfromdifferenthostsandtheiradaptabilitytosoybean

Wang Huimin1， Zhao Honghai1， Wang Fenglong2

(1.CollegeofAgronomyandPlantProtection，QingdaoAgriculturalUniversity，KeyLaboratoryofIntegratedCropPestManagementofShandongProvince，Qingdao266109，China; 2.TobaccoResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Qingdao266101,China)

Based on both morphological and molecular identification of 14 soybean cyst nematode (SCN) populations on soybean, tobacco and rehmannia, cyst and vulval cone were characterized by morphological observation and morphometry. The results showed that SCN populations collected from tobacco and soybean had no obvious difference in morphological measurements (P>0.05), but the fenestral length (43.8 μm)and width (33.9 μm)in the population collected from rehmannia were obviously shorter than those of SCN from other two hosts (P<0.05). There were some morphological differences in different SCN populations collected from the same host. The length of vulval slit and underbridge could be used as reliable identification characters for their high stability.SCN populations collected from soybean could infect soybean cultivar ‘Hedou 12’ and produced females; however，the populations collected from tobacco and rehmannia failed to infect the soybean cultivar or formed females. The results indicated that there were variations in morphological characters and host adaptability of different populations of SCN.

Heteroderaglycines; morphological variation; molecular identification; host adaptability

2014-03-19

：2014-05-12

中國煙草總公司科技項目(110200902065)；公益性行業(農業)科研專項(200903040)；山東省“泰山學者”建設工程專項

S 435.651

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.06.019

致謝：沈陽農業大學段玉璽教授和陳立杰教授為本研究提供遼寧省大豆孢囊線蟲樣品，青島農業大學植病專業碩士研究生王磊磊和李志輝參加部分調查工作，在此表示感謝。

* 通信作者 E-mail:hhzhao@qau.edu.cn