參麥對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的干預作用

何艷芳，郭學芬，王 軍

(1. 河南省新鄉市中心醫院，河南 新鄉 453000；2. 河南省輝縣婦幼保健院，河南 輝縣 453600；3. 徐州醫學院第一附屬醫院，江蘇 徐州 221000)

參麥對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的干預作用

何艷芳1，郭學芬2，王 軍3

(1. 河南省新鄉市中心醫院，河南 新鄉 453000；2. 河南省輝縣婦幼保健院，河南 輝縣 453600；3. 徐州醫學院第一附屬醫院，江蘇 徐州 221000)

目的 研究參麥注射液對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷(HIBD)的干預作用。方法 建立新生鼠HIBD模型。免疫組化方法檢測缺氧缺血(HI)后2 h、12 h、24 h、3 d、7 d、14 d各時間點新生大鼠右側大腦海馬CA1區Bax、Bcl-2蛋白表達情況。實驗各觀察點隨機分為假手術組(S組)、參麥注射液治療組(SM組)、生理鹽水對照組(C組)，每組9只。結果 HI后2 h，SM組、C組右側大腦海馬CA1區Bcl-2蛋白表達及Bax蛋白表達均已有升高，24 h達到高峰，14 d各組降到與SM組同一水平:SM組、C組在2 h、12 h、24 h、3 d、7 d點與S組比較均有顯著性差異，在14 d與S組比較無顯著性差異；SM組在24 h、3 d、7 d與C組比較，Bcl-2蛋白表達較C組高，在2 h、12 h、14 d點與C組比較無顯著性差異。SM組在12 h、24 h、3 d、7 d與C組比較，Bax蛋白表達較C組降低，在2 h、14 d與C組比較無顯著性差異。結論 參麥注射液可以提高抑制凋亡基因Bcl-2的表達及降低促凋亡基因Bax的表達。

參麥注射液；缺氧缺血性腦損傷；Bax；Bcl-2

本研究旨在探討參麥注射液對新生大鼠缺氧缺血(HI)后大腦海馬CA1區Bax、Bcl-2蛋白的干預作用。

1 實驗資料

1.1 動物 7 d齡新生SD大鼠(徐州醫學院院實驗動物中心提供),雌雄不限,體質量12～16 g。

1.2 主要藥品、試劑以及主要儀器 8%O2、92%N2混合氣體(上海特種氣體廠)，參麥注射液(雅安三九藥業有限公司)，常壓缺氧艙(上海市兒科研究所)，兔抗Bcl-2抗體、兔抗Bax抗體、SP試劑盒、聯苯二胺顯示劑(DAB)、枸櫞酸鈉、磷酸鹽緩沖液均購自北京中山公司。

1.3 方法 將新生7 d SD大鼠參照Rice法,乙醚吸入麻醉后,結扎鼠右側頸總動脈,術畢2 h后置容器中持續吸入8%O2、92%N2混合氣體,流速2.0 L/min,以鈉石灰吸收CO2,持續2 h，建立HIBD模型。將HIBD模型大鼠隨機分為假手術組(S組)、參麥注射液治療組(SM)組、生理鹽水對照組(C組)，各9只。S組僅切開頸正中皮膚和分離右側頸正中動脈,不結扎,不缺氧。SM組于HI后即刻腹腔注射參麥注射液10 mL/kg,1次/d,在缺氧缺血后7 d內,按觀察時間連續用藥直至7 d。C組采用生理鹽水，用法用量同SM組。免疫組化方法檢測缺氧缺血(HI)后2 h、12 h、24 h、3 d、7 d、14 d各時間點新生大鼠右側大腦海馬CA1區Bax、Bcl-2蛋白的表達情況。將鼠以10%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射麻醉，斷頭取腦，用4%多聚甲醛固定3 d，石蠟包埋，連續切片，按序間隔留片，并分別貼片后取其中Ⅰ～Ⅱ套留作免疫組化。切片用免疫組織化學染色(SP法)后，LEICA Qwin圖像處理與分析系統測定右腦海馬CA1區錐體神經元Bcl-2、Bax蛋白表達灰度值。

1.4 檢測指標 切片用免疫組織化學染色(SP法)后,LEICA Qwin圖像處理與分析系統測定各組新生大鼠右海馬CA1區錐體神經元Bcl-2和Bax蛋白表達灰度值。

2 結 果

2.1 HI后各組大鼠海馬CA1區Bcl-2表達情況 見表1及圖1～6。

2.2 HI后各組大鼠海馬CA1區Bax表達情況 見表2及圖7～12。

表1 HI后各組大鼠右側海馬Bcl-2灰度值比較

注：①與S組比較,P<0.05;②與S組比較，P<0.01；③與C組比較，P<0.01。

圖1 HI后24 h假手術組新生大鼠海馬CA1區Bcl-2的表達

圖2 HI后24 h對照組新生大鼠海馬CA1區Bcl-2的表達

3 討 論

圖3 HI后24 h參麥組新生大鼠海馬CA1區Bcl-2的表達

圖4 HI后3 d假手術組新生大鼠海馬CA1區Bcl-2的表達

圖5 HI后3 d對照組新生大鼠海馬CA1區Bcl-2的表達

圖6 HI后3 d參麥組新生大鼠海馬CA1區Bcl-2的表達

組別2h12h24h3d7d14dS組5.53±0.635.32±0.875.09±1.165.40±1.025.39±0.905.4±0.86SM組7.78±1.06①16.72±1.39②③21.86±2.03②④15.3±1.34②④7.54±1.42①③5.6±1.27C組8.0±1.02①16.96±1.40②30.44±1.20②19.22±1.77②9.34±1.30①5.8±1.18

注：①與S組比較,P<0.05;②與S組比較，P<0.01；③與C組比較，P<0.05。

圖7 HI后24 h假手術組新生大鼠海馬CA1區Bax的表達

圖8 HI后24 h對照組新生大鼠海馬CA1區Bax的表達

圖9 HI后24 h參麥組新生大鼠海馬CA1區Bax的表達

圖10 HI后3 d假手術組新生大鼠海馬CA1區Bax的表達

圖11 HI后3 d對照組新生大鼠海馬CA1區Bax的表達

圖12 HI后3 d參麥組新生大鼠海馬CA1區Bax的表達

段濤等[1]研究表明，新生兒缺氧缺血性腦損傷后遲發性神經元死亡的發生與細胞凋亡密切相關,其機制極為復雜,可能涉及線粒體損傷導致的能量代謝障礙、氧自由基、損傷、細胞內鈣超載、興奮性氨基酸及其受體毒性、體液因子、炎癥細胞和炎癥因子、細胞因子損傷等各個方面。參麥注射液組方源于《千金要方》之生脈散，是根據祖國傳統醫學的經典方劑修正而成的復方制劑，已廣泛用于臨床。參麥注射液的有效成分是人參皂甙和人參多糖,具有清除氧自由基、抗脂質過氧化、保護內皮細胞作用,可擴張外周血管,增加冠脈血流量,提高心肌對缺氧、缺血的耐受性,減輕心肌缺血,縮小心肌梗死范圍,保護、修復心肌細胞[2]。俞銳敏等[3]

證實了不同劑量參麥注射液對機體的作用。結合預實驗及參麥注射液藥理研究結果，本實驗選用10mL/kg這一劑量。在細胞凋亡調控機制方面，Bcl-2家族是迄今為止研究得最深入，廣泛的凋亡調控基因之一[4]。Bcl-2作為一種廣義的抑制凋亡基因,其功能主要是抑制細胞凋亡，促進細胞生存，它通過羧基端的信號錨定序列跨線粒體膜而發揮作用,在線粒體上可直接調節膜上通透性轉換孔來調節線粒體膜的通透性,以阻止細胞色素C釋放入胞質而抑制細胞凋亡[5]。Bax基因亦為Bcl-2家族成員,結構與Bcl-2有21%的相似性,其作用則與Bcl-2相反,活化的Bax可使線粒體和脂質體通透性增加,啟動凋亡信號,具有促凋亡作用。而Bcl-2可抑制Bax的活化,從而抑制細胞凋亡。本實驗結果顯示：與生理鹽水對照組相比，參麥治療組大鼠海馬神經元CA1區Bcl-2蛋白表達細胞數明顯增加，Bax蛋白表達細胞顯著減少，表明參麥注射液可能通過調節Bcl-2、Bax蛋白的表達抑制神經凋亡。

[1] 段濤,陳超. 新生兒缺氧缺血性腦病(Ⅱ)[J]. 中華醫學雜志,2005,8(5):129-133

[2] 歐陽修河，尹睿，張穎. 參麥注射液對無創通氣治療慢性阻塞性肺病并嚴重呼吸衰竭的影響[J]. 中國中西醫結合雜志，2006，26(7)：608-611

[3] 俞銳敏，熊愛華，楊欽河. 參麥注射液對大鼠急性心肌缺血及eNOSmRNA表達的影響[J]. 中國病理生理雜志，2006，22(6)：1083-1086

[4] 周斌，于博，姚南，等. 三七總皂甙對梗阻性黃疸肝組織中Bax，Bcl-2表達的影響及意義[J]. 第四軍醫大學學報，2006，27(19)：1765-1770

[5] 王漢民,吳雄飛,譚華等. 川芎嗪對缺血/再灌注損傷大鼠腎臟細胞凋亡及Bcl-2和Bax表達的影響[J]. 第四軍醫大學學報,2006，27(20)：1884-1889

Effects of Shenmai injection on hypoxic-ischemic brain damage of neonatal rats

He Yanfang1, Guo Xuefeng2, Wang Jun3

(1.The Central Hospital of Xinxiang, Xinxiang 453000, Henan, China; 2.Matern and Child Health Care Hospital of Huixian County, Huixian, Henan, China 453600; 3.The First Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu, China 221000)

Objective It is to investigate the intervention effect of Shenmai injection on neonatal rats with hypoxic-ischemic brain damage. Methods Neonatal rat models with HIBD were established. Immunohistochemistry was used to detect the expression of Bax and Bcl-2 in the hippocampal CA1 region of right brain in neonatal rats with HIBD at 2 h, 12 h, 24 h, 3 d, 7 d, 14 d after hypoxic-ischemic (HI) insult. Every observed spot was separated into three groups: sham operation (S), control group (C) and Shenmai injection treatment (SM). Results The expression of Bcl-2 in right hippocampal CA1 region in group SM, group C at 2 h after HI insults had already began to increase, peak at 24 h and then gradually decreased. The expression of Bcl-2 in right hippocampal CA1 region in every group had no difference at 14 d (P>0.05). The expression of Bcl-2 in right hippocampal CA1 region in group SM at 24 h, 3 d， 7 d was significantly more than that of group C(P<0.05,P<0.01). The expression of Bcl-2 in right hippocampal CA1 region in group SM and group C had no difference at 2 h, 12 h, 14 d (P>0.05). The expression of Bax in right hippocampal CA1 region in group SM, group C at 2 h after HI insults had already began to increase, peak at 24 h and then gradually decreased. The expression of Bax in right hippocampal CA1 region in every group had no difference at 14 d (P>0.05). The expression of Bax in right hippocampal CA1 region in group SM at 12 h, 24 h, 3 d, 7 d was significantly less than that of group C(P<0.05,P<0.01). The expression of Bax in right hippocampal CA1 region in group SM and group C had no difference at 2 h, 14 d(P>0.05). Conclusion Shenmai injection can significantly enhance the expression of Bcl-2 in right hippocampal CA1 region and decline the expression of Bax in right hippocampal CA1 region.

Shenmai injection; hypoxic-ischemia brain damage; Bax; Bcl-2

何艷芳，女，主治醫師，碩士，主要從事新生兒疾病的診治工作。

王軍，Tel：18052268109

10.3969/j.issn.1008-8849.2014.05.007

R-332

A

1008-8849(2014)05-0475-04

2013-05-10