骨髓間質干細胞貼壁篩選法的提純

任瑞芳， 黃良國， 黃名璐， 蔣國紅， 白 潔

骨髓間質干細胞(mesenchymaI stem cells，MSCs)是骨髓細胞中的粘附細胞部分，也稱為塑料粘附細胞，在骨髓中參與構成造血干細胞的生存和分化的微環境，且特定條件或微環境下可以分化為神經細胞［1］、心肌細胞［2］、和肌腱［3］等多種細胞。其特點有:(1)取材方便易于分離培養，避免了胚胎細胞的相關倫理問題;(2)具有強大的增殖和自我更新能力可跨胚層分化為多種細胞，使不可再生細胞的再生成為可能;(3)處于未分化的原始細胞狀態，不存在主要組織相容性復合體(MHC)，避免了免疫排斥問題，還可自由通過血腦屏障到達腦內的各個部位［4，5］。為細胞移植的實驗研究提供了極大的方便，具有廣闊的研究前景和極大的臨床實用價值。成為了目前醫學領域研究最熱門的焦點細胞之一。因此摸索一個簡單、高純度MSCs體外培養和擴增的方法極為重要。本實驗通過貼壁篩選法分離培養大鼠MSCs，并利用流式細胞術檢測其表面標志以確定其純度。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

健康SD大鼠，雌雄不限，80～150 g(重慶第三軍醫科大學提供)。L-DMEM培養液、Hyclone胎牛血清、胰蛋白酶(Hyclone公司)，二甲基亞楓(北京拜爾迪生物公司)，小鼠抗大鼠CD29-FITC、小鼠抗大鼠CD45-PE、小鼠抗大鼠CD90-PE(USBiological公司)，小鼠IgG-PE(BD Bioscierces公司)、IgG-FITC(Biolegend公司)，青霉素鈉、硫酸鏈酶素(華北制藥廠)。

1.2 主要儀器

超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)，CO2孵箱(Thermo，美國)，高壓消毒鍋(TOMY，日本)，－20℃冰箱(青島海爾)，－80℃冰箱(Forma Scientic，德國)，離心機DT5-1(北京時代北利離心機有限公司)，MILLI-Q超純水純化系統(Forma Scientic，德國)，光學倒置顯微鏡(OLYMPUS，日本)，流式細胞儀(Becton-Dickinson，美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 MSCs的分離、培養及篩選 取4 w左右健康清潔SD大鼠，脫臼處死后，置75%乙醇浸泡10 min，無菌情況下剪取雙側股骨及脛骨，于超凈臺內用PBS緩沖液沖洗數次，剪去骨周圍組織及兩端軟骨，用20 ml注射器抽取L-DMEM單純培養基反復沖洗骨髓腔，分離骨髓細胞于離心管中，1 000 r/min離心5 min，去上清，加入含10%胎牛血清的L-DMEM培養基后接種于25 cm2塑料培養瓶中，至37℃、5%CO2孵箱中培養，24 h半換液、48 h全換液，逐漸去除未貼壁的懸浮細胞和死細胞，以后每2 d全換液1次，并觀察細胞生長狀況。培養至7～8 d后培養瓶內細胞融合至80% ～90%時進行傳代，用PBS液緩慢沖洗2遍，加入0.25%胰蛋白酶1～2 ml，倒置顯微鏡下觀察細胞開始收縮、變圓，細胞間隙逐漸增大時棄去胰酶，加入含10%胎牛血清的L-DMEM培養液終止消化，用吸管反復沖吹瓶壁，使細胞脫落，制成單細胞懸液。視細胞量按1∶2或1∶3傳代，此時記為P1(第1代)，以后每3 d左右傳代1次。

1.3.2 MSCs 的鑒定 通過流式術對大鼠MSCs表面標記物(CD29、CD45、CD90)進行檢測:取細胞P1～10的細胞，棄去培養基，用 PBS洗滌2次，加入0.25%胰酶消化、離心(1000 r/min，5 min)收集細胞后，PBS重懸細胞，再次離心(1000 r/min，5 min)，棄上清，用 200 μl PBS液制成 5×105個MSCs的細胞懸液。分別將其分為3組，第1組加入大鼠IgG-FITC、IgG-PE各5 μl作對照，第2組加入大鼠 CD29-FITC、CD45-PE 各 5 μl，第 3 組加入CD90-PE 5 μl，混勻后室溫避光 25 min，每管加入PBS液 2 ml，振蕩器混勻后離心(1000 r/min，5 min)，棄上清，加入2%多聚甲醛200 μl固定，待上機檢測。

2 結果

2.1 鏡下觀察MSCs

L-DMEM培養液中的全骨髓細胞接種至細胞培養瓶后，倒置顯微鏡下可見均一密集的橢圓形細胞，折光性強。24 h半換液后可見少量細胞貼壁生長，3 d全換液有部分細胞貼壁，倒去未貼壁的漂浮細胞后，可見有部分細胞由橢圓形變為多角形、短棒或短梭形等形態。4～6 d時，細胞折光性更強，并不斷分裂增殖，細胞由短梭形、多角形變為長梭形，并逐漸擴散、相互交聯，成集落樣分布。7～8 d時，細胞均為長梭形。細胞傳代后鏡下可見形態呈一致的長梭狀，且分布均勻。細胞的增殖速度較原代明顯增快，3 d左右即可融合達80% ～90%(見圖1)。

2.2 流式細胞術檢測MSCs

流式細胞術檢測大鼠MSCs表型，結果顯示P3～6細胞CD29、CD90陽性率均大于90%，CD45陽性率均小于10%。細胞在P1～2時純度逐漸升高。在P7～10時純度逐漸降低(見圖2)。

3 討論

MSCs是來源于中胚層的除非造血干細胞以外的一類干細胞，20世紀70年代Friedenstein等首次從骨髓中分離出MSCs，雖然其在骨髓內含量較低，它取材方便，容易分離、獲得及培養，具有高度增殖及自我更新能力，且免疫原性低，另外MSCs易于外源基因的轉染和表達，不論質粒還是病毒均可攜帶目的基因轉染 MSCs，而其功能不受影響［6，7］，可作為細胞移植治療中樞神經系統疾病基因治療的有效載體。隨著研究的深入及技術的改進，目前獲得MSCs的常見方法主要有以下幾種［8，9］:密度梯度離心法(Percoll)、貼壁篩選法、免疫磁珠法和流式細胞儀分選法。這些方法中，密度梯度離心法由于反復離心，可能致使骨髓微環境中對MSCs生長有利的細胞因子和促貼附物質丟失，而不利于細胞的體外擴增;而流式細胞儀分選法和免疫磁珠法實驗成本昂貴，骨髓需要量大，對細胞的活性影響較大，甚至導致完全失活，且難以獲得大量高純度的MSCs。因此，本實驗采用貼壁篩選法，根據MSCs在塑料組織培養皿中貼壁生長，而白細胞和造血干細胞是懸浮生長對其進行逐步分離。MSCs在骨髓中密度很低，且隨動物年齡增長而減少，故本實驗選用幼年大鼠骨髓在L-DMEM培養基中培養，經歷潛伏期、指數增生期和停滯期。原代細胞24 h即可貼壁，培養4～6 d呈對數生長，7 d達平臺期。此方法獲得的細胞生長良好且增殖快。

MSCs是一個異質細胞群，未發現特異性表型抗原;為了便于分析相關研究結果，國際細胞治療學會統一了MSCs的鑒定標準，確定其表面抗原特征為［10］:CD73、CD90、CD105 CD29、CD106、CD146、胰島素樣生長因子受體(IGFR)、神經生長因子受體(NGFR)、血小板源性生長因子受體(PDGFR)、骨特異性堿性磷酸酶(STRO-3)等表達陽性，而CD45、CD34、CD79α或CD19以及 HLA 2DR陰性。本實驗通過檢測CD29、CD45和CD90來鑒定P1～10的MSCs，結果顯示;P3～6大部分細胞表達CD29和CD90，極少量細胞表達CD45，提示所培養細胞為高純度MSCs，適于做組織工程的種子細胞。

分離培養MSCs的方法中貼壁篩選法具有操作簡單、便捷，對細胞活性影響小等優點，有利于MSCs的貼壁、增殖和篩選，且體外培養條件下生長性狀穩定，篩選的MSCs純度很高。

圖1 A:原代細胞5 d;B:第4代MSCs(×100)

圖2 流式細胞術檢測第4代MSCs示:大部分細胞表達CD29和CD90，極少量細胞表達CD45

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