丹紅注射液對腦梗死患者外周血中血管內皮生長因子的影響

李文玉， 董斌春， 王 路， 王曉紅， 楊 鑫， 宋春伶

急性腦梗死后成人腦組織再生能力有限，血管新生及側枝循環建立是治療關鍵，對腦梗死后神經元存活及預后有重要意義，但其內源性保護機制、細胞信號轉導途徑等過程尚未闡明。正常機體內存在多種促血管新生的因子，與抑制血管新生因子相互作用，兩者保持平衡。促進血管新生因子主要包括:VEGF、bFGF、轉化生長因子(TGF-α)、血小板源生長因子(PDGF)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、胎盤生長因子(PIGF)。抑制血管新生因子目前發現的有:血管生成抑素(angiostatin)、內皮抑素(endostatin)、凝血酶敏感蛋白(TSPs)、干擾素α、干擾素β、色素上皮源性生長因子(PEDF)、白細胞介素10、12(IL-10、IL-12)等。

目前研究較多的是VEGF及bFGF在血管新生中的作用，VEGF是一種重要的促血管新生因子，腦組織正常情況下無VEGF表達，腦缺血、缺氧后，VEGF/VEGF受體(VEGFR)系統被激活，誘導VEGF高表達，并與其受體結合，刺激神經元生長，對神經系統起直接保護作用，并延長細胞存活時間［1～3］，促使內皮細胞增殖，誘導血管形成［4，5］，改善缺血半暗帶區血流供應，為腦組織重建、功能恢復提供基礎環境。bFGF是一種血管活性多肽，可能通過上調超氧化物歧化酶起到抗氧化作用，減少缺血再灌注損傷后細胞凋亡，從而減少組織壞死［6］。郭翠平等在其實驗中發現VEGF、bFGF在缺血預處理大鼠局灶性腦缺血再灌注區域表達明顯增高，缺血面積及缺血程度均減輕，推測兩者可能對缺血再灌注鼠神經細胞起保護作用［7］。

本文中我們著重研究腦梗死后外周血中VEGF水平變化，通過在不同條件處理下VEGF的濃度間接反應其對血管新生的影響，以及應用丹紅注射液后對VEGF的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

恒溫水浴箱(HG-75-4，南京)、酶標分析儀(PHOMO，鄭州安圖生物工程有限公司)、離心機(3K15，德國Sigma公司)、注射用丹紅注射液，菏澤步長制藥有限公司生產，規格10 ml。人血管內皮生長因子定量酶聯檢測試劑盒(吉林恒晟生物科技有限公司生產，長春)。

1.2 病例選擇

隨機選取于本科住院的腦梗死患者60例，發病均在48 h內，全部病例均符合1995年第四屆全國腦血管病學術會議制定的《各類腦血管疾病的診斷要點》診斷標準，并經頭部CT或MRI檢查證實，排除顱內出血及其他顱內疾患。另除外下列情況:(1)年齡＜18歲的住院患者;(2)嚴重肝腎功能障礙;(3)全身出血傾向或出血性疾病;(4)過敏體質患者;(5)處于妊娠期或哺乳期的婦女。共入選60例，其中男37例，女23例。年齡43～82歲，平均57.02 ±10.21 歲。

1.3 治療方法

將入選的60例新發腦梗死患者隨機分為丹紅注射液治療組與對照組，治療組30例(男21例，女9例，平均年齡55.67±9.87歲)，對照組30例(男20例，女10例，平均年齡 57.48 ±11.33 歲)，其中治療組使用常規治療，即改善循環，營養神經，抗血小板聚集治療，并加用丹紅注射液40 ml溶解于0.9%生理鹽水100 ml中，每日1次靜脈輸注(輸注時間為1 h);而對照組使用常規治療。兩組均以7～12 d為1個療程，在用藥前24 h和用藥周期內，嚴禁使用ACEI類降壓藥物。兩組患者高血壓、冠心病、糖尿病、高脂血癥等危險因素無明顯差異，具有可比性，并均對上述疾病進行治療。

1.4 樣品的提取及保存

分別于入院后2 d與治療12 d后采靜脈血(用EDTA抗凝)，經離心后將上層清夜即血漿分離出來，放入－20℃冰箱保存，樣品血漿于實驗前24 h內放入2～8℃冰箱保存，于實驗前0.5～1 h取出在室溫下擱置，以備檢測血漿中VEGF的含量，進行比較。

1.5 檢測 VEGF

操作步驟嚴格按照說明書進行(采用雙抗體夾心ELISA法)。(1)實驗前30 min取出試劑盒，以平衡至室溫(20～25℃)。(2)取出所需板條，剩余密封放回4℃冷藏。配置洗滌液(濃縮洗滌液與蒸餾水1∶30倍稀釋)。(3)建立標準曲線:設標準孔10孔，在第1孔、第2孔中分別加入標準品100 μl，然后在第1孔、第2孔中分別加入標準品稀釋液50 μl，混勻，然后從第 1 孔、第 2 孔中各取 100 μl分別加到第3孔和第4孔，再在第3孔、第4孔分別加入標準品稀釋液50 μl，混勻，然后從第3孔和第4孔中先各取50 μl棄掉，再各取50 μl分別加到第5孔、第6孔，然后在第5孔、第6孔中分別加入標準品稀釋液50 μl，混勻，然后從第5孔、第6孔中各取50 μl分別加到第7孔、第8孔，再在第7孔、第8孔中分別加入標準品稀釋液50 μl，混勻，然后從第7孔、第8孔中各取50 μl分別加到第9孔、第10孔，再在第9孔、第10孔中分別加入標準品稀釋液50 μl，混勻，然后從第 9 孔和第 10 孔中各取 50 μl棄掉。使之各孔體積均為50 μl。(濃度分別為900 pg/L、600 pg/L、300 pg/L、150 pg/L、75 pg/L)。(4)加樣:分別設空白對照孔(空白對照孔不加樣品和酶標抗體工作液，其余各步操作相同)和待測樣品孔。在待測樣品孔中先加入樣品稀釋液40 μl，然后再加樣品10 μl，(樣品最終稀釋了5倍)。將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕搖動混勻。(5)用封板紙封板后置37℃ 30 min。(6)洗板:小心揭掉封板紙，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，向濾紙印干。(7)每孔加入酶標抗體工作液50 μl，輕輕搖動混勻。(8)用封板紙封板后置37℃ 30 min。(9)洗板:小心揭掉封板紙，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，向濾紙印干。(10)每孔先加入底物液 A 50 μl，再加入底物液 B 50 μl。(11)將反應板充分混勻后置37℃暗處反應15 min。(12)每孔加入終止液50 μl，混勻，終止反應。此時藍色立轉黃色。(13)以空白孔調零，在45 nm處測吸光值。測定應在加終止液后15 min內進行。

1.6 測定結果計算與判斷

(1)以標準品濃度分別為900 pg/L、600 pg/L、300 pg/L、150 pg/L、75 pg/L之 OD值得出標準曲線。將濃度作為X軸(對數軸)，OD值作為Y軸(線性軸)。(2)根據樣品OD值代入標準曲線算出相應人VEGF含量，再乘以稀釋倍數5。

1.7 統計學處理

2 結果

經統計軟件分析后得出:治療前兩組VEGF水平相比，差別無統計學意義(P＞0.05)，治療后兩組VEGF水平相比，差別有統計學意義(P＜0.05)(見表1、圖 1)。

表1 兩組治療前后VEGF水平變化(pg/mg，)

表1 兩組治療前后VEGF水平變化(pg/mg，)

組別VEGF治療組(30例) 對照組(30例)治療前治療后72.2 ±9.71 74.5 ±16.85 70.9 ±6.31 71.7 ±11.26

圖1 兩組治療前后VEGF水平變化

3 討論

3.1 腦梗死與VEGF

3.1.1 VEGF對血管生成的影響 VEGF是影響血管生成一個關鍵的因素，腦梗死后VEGF介導血管生成的治療潛力逐漸得到重視，一些研究顯示VEGF是血管生成過程、神經保護和腦缺血后神經再生最重要的生長因子。腦梗死后VEGF表達上調，低氧依賴性HIF-1、HIF-2也參與VEGF表達，低氧是增加VEGF表達的一個關鍵［8］。缺血性梗死后，VEGF和VEGFRs在梗死部位、缺血半暗帶區以及較遠處皮質區域都有明顯表達，其中主要是通過脈絡叢上皮細胞和小腦，也通過海馬神經元和齒狀回(DG)和星形膠質細胞和小膠質細胞。VEGF的兩個受體VEGFR-1和VEGFR-2在缺血48 h后先后在缺血灶周圍及缺血區表達。此外，在缺血再灌注后大約3 d VEGF-C和VEGFR-3在CA1和齒狀回開始表達，并至少持續14 d，這種改變與缺血性損傷后星形膠質細胞聚集時間點有關。腦梗死后缺血周圍血管會再生，事實上已經證實腦梗死后VEGF明顯加速了血管生成，促進神經功能恢復［9，10］。此外，Harrigan等［11］發現在心室內緩慢注入VEGF165與血管密度增加呈劑量依賴關系，VEGF有增強血管生成的作用是由VEGF通過下游VEGFR-2介導而生成。Sun等［5］證實在缺血再灌注的1～3 d腦室通過VEGF調節可以減小梗死面積，提高神經系統功能，增加并延長齒狀回(DG)和腦室下區(SVZ)神經元新生。然而，VEGF在腦缺血中的急性效應極其復雜的，這種神經保護作用機制尚未完全闡明。有研究證實VEGF神經保護作用是通過刺激血管內皮細胞及神經元細胞實現的，VEGFR-2與VEGF提高內皮細胞和神經元生存的能力密切相關;VEGFR-1則與VEGF減小腦梗死面積，減輕腦水腫有關［12］;下游的受體水平、信號PI3-K/Akt和ERK1/2等因素均有助于提高VEGF神經保護作用。有實驗發現缺氧和葡萄糖不足時，VEGF通過VEGFR-2和PI3-K途徑減少細胞死亡。

3.1.2 VEGF對神經發生的影響 VEGF作為內源性神經保護因子除具有促進血管生成的作用，還可抑制細胞凋亡、刺激神經再生，并對膠質細胞的增殖、分化有直接促進作用，這種作用可能與少突膠質前體細胞(oligoderndrocyte precursor cells，OPC)有關。OPC在不同環境下可以分化為星形膠質細胞(Ast)、少突膠質細胞(OL)、甚至可以分化為神經元［13］。星形膠質細胞在微環境中發揮著重要作用，而少突膠質細胞則是神經系統髓鞘形成細胞，在信息傳遞及整合方面起著重要作用。此外，OPC能夠分泌神經營養因子和神經生長因，如神經生長因子、胰島素樣生長因子等，促進神經系統發育。腦缺血缺氧后，VEGF在腦缺血區促進血管生長、促進細胞存活的同時還通過FLK-1促進神經前體細胞增殖，并通過Nocth信號通路對OPC起到促進增殖作用，為其遷移到受損部位以完成修復功能提供前提條件。VEGF能直接刺激體內外的神經發生［14～16］，VEGF則能上調這些區域的神經發生［2，5］。事實上，在攜帶VEGF基因的鼠實驗中，腦梗死1～4 w室管膜下區神經再生明顯增加，成神經細胞鏈從室管膜下區一直擴展到缺血半暗帶層，腦梗死2～4 w后大腦皮質新生成的神經元顯著增加。也有研究發現重組腺病毒VEGF-1相關病毒可能通過提高SVZ區的神經發生和促進神經前體遷移到缺血病變周圍組織，進而減少梗死病灶的大小并促進神經功能恢復。VEGF在體外誘導神經元增殖研究中需要PLC、PKC、PI3-K、MEK 參與，并進一步通過上調E2F的表達促進皮質神經元的增殖［17］。VEGF可能通過提高腦缺血后神經發生，對腦損傷的修復起到治療作用。

3.2 丹紅注射液與VEGF

本實驗中治療后VEGF均有升高，丹紅治療者較對照組升高明顯，其差別具有統計學意義(P＜0.05)，說明丹紅注射液可以增加缺血性腦卒中患者血液中VEGF的表達，VEGF含量的增加對促進腦缺血區血管的新生及神經細胞再生發揮了一定的積極作用。丹紅注射劑由丹參、紅花提煉而成，主要成分有丹參酮、丹參酚，紅花黃醇酮、紅花黃色素等，前兩者有降低血栓烷素A2水平、抗血小板聚集、降低血漿中D-二聚體及纖維蛋白原從而降低血液黏度［18］及紅細胞聚集指數，改善微循環，抑制動脈粥樣硬化形成、清除自由基作用;后兩者則有抗凝溶栓、改善ATP酶活性、刺激組織纖溶酶活性物質釋放，調節纖維蛋白溶解活性進而起到防止血栓形成及促進血栓溶解作用［19］。目前丹紅注射液已廣泛應用與臨床，治療心腦血管等疾病，臨床療效觀察發現急性腦梗死患者在早期應用該藥后，患者神經功能恢復及預后均有提高。席曉華等研究中證實丹紅注射液有促進血管新生、側枝循環擴張、抗血小板聚集、降低血栓烷素B2水平、抗血栓形成、抗氧化和清除自由基、提高細胞耐缺氧能力等作用，譚來勛等在動物實驗中發現其可促進大鼠腦梗死區星形膠質細胞增殖、突觸數目增加，從而達到促進運動功能恢復的作用。我們的試驗結論也證實使用丹紅注射液后患者血中VEGF水平明顯提高，間接證實丹紅注射液可能在缺血性腦卒中患者血管再生及神經功能恢復中發揮了積極作用。

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