HPLC法測定大鼠肝微粒體中UGT酶的底物

洪麗霞,呂紅霞,石明芯,王佳慧,代晶(成都醫學院藥學院,成都 610083)

·論 著·

HPLC法測定大鼠肝微粒體中UGT酶的底物

洪麗霞,呂紅霞,石明芯,王佳慧,代晶*
(成都醫學院藥學院,成都 610083)

目的 建立測定大鼠肝微粒中UGT酶底物的HPLC方法。方法 選擇對硝基酚、對乙酰氨基酚作為UGT的特異性底物。采用高效液相色譜法,分別以非那西丁、咖啡因作為內標,色譜柱為 Welchrom C18,體積流量為1 mL/min,柱溫為30 ℃。對硝基酚和對乙酰氨基酚的流動相分別為乙腈-0.01 mol/L的醋酸銨緩沖液(pH 5.00)=35∶65和乙腈-水=14∶86, 對應的檢測波長分別為316 nm和244 nm。 結果 對硝基酚和對乙酰氨基酚在0.5～100 μmol/L范圍內,線性關系良好。對硝基酚的日內精密度和日間精密度RSD%﹤14.7%,方法回收率為89.9%～111.0%,提取回收率>86.5%。對乙酰氨基酚的日內精密度和日間精密度RSD%﹤13.0%,方法回收率105.6% ～114.2%,提取回收率>78.3%。結論 兩組方法靈敏、簡便、準確,可用于大鼠肝微粒體中UGT酶活性的測定。

高效液相色譜法；尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶；對硝基酚；對乙酰氨基酚；肝微粒體

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶(UGT) 是生物體內重要的Ⅱ相代謝酶,其主要作用是催化內源及外源化合物進行葡萄糖醛酸結合反應,增加其極性,便于隨尿及膽汁排出體外。 UGT廣泛分布于腎臟、腦、皮膚、腸、脾、胸腺、心臟等組織,其中以肝臟中該酶的活性最高[1]。在藥物的Ⅱ相代謝反應中,這種反應占到35%[2],因此研究藥物與UGT 酶的關系,對藥物相互作用、解毒排毒機制的研究具有十分重要的意義。本文選擇對硝基酚、對乙酰氨基酚為UGT底物[3,4], 建立測定大鼠肝微粒體中UGT酶底物的HPLC法。該方法簡單、靈敏度高、準確度好,可為UGT酶活性的測定提供參考方法。

1 材料與方法

1.1 材料

非那西丁和對乙酰氨基酚(中國藥品生物制品檢定所,批號分別為100095-198904、100018-200408),對硝基酚(成都科龍化工試劑廠,批號：070608),色譜純乙腈(美國Dikma公司),其余試劑均為分析純。高效液相色譜儀(美國戴安公司),包括P680泵、ASI-100自動進樣器、UV1700型檢測器、TC100柱溫箱和Chromeleon工作站。SD大鼠10只(雄性,體質量250±20 g)購自四川大學華西實驗動物中心,合格證號:SYXK(川)2008-113。

1.2 溶液的配制

取非那西丁和咖啡因對照品適量,精密稱定,用甲醇溶解稀釋配制成0.5 mmol/L的對照品溶液。分別取對硝基酚、對乙酰氨基酚適量,精密稱定,用甲醇稀釋配制成10 mmol/L的貯備液,再用甲醇稀釋濃度為1 000、500、200、100、50、20、10、5 μmol/L的系列標準溶液。上述溶液置于4 ℃冰箱中保存,備用。

1.3 肝微粒體的制備與測定

[5]制備大鼠肝微粒,并測定蛋白濃度。

1.4 樣品前處理方法

分別取對硝基酚和對乙酰氨基酚對照品溶液50 μL,揮干溶劑,加入肝微粒體和0.1 mol/L Tris-HCl(pH7.4)緩沖液,使溶液的終體積為0.5 mL,蛋白的終濃度為0.5 g/L。再加入乙酸乙酯2.0 mL,內標溶液50 μL,渦旋萃取3.0 min,取有機層揮干溶劑,殘渣用0.1 mL流動相溶解,取20 μL進樣分析。

1.5 色譜條件

色譜柱為Welchrom C18柱(250×4.6 mm,5 μm),柱溫為30 ℃,體積流量為1.0 mL/min。對硝基酚的流動相為乙腈-0.01mol/L的醋酸銨緩沖液(pH5.0)(35∶65),檢測波長為316 nm；對乙酰氨基酚的流動相為乙腈-水(14∶86),檢測波長為244 nm。兩組柱溫均為30 °C,流速為1.0 mL/min。

1.6 分析方法的驗證

試驗對兩組HPLC法進行了系統適用性、線性、定量下限、精密度、回收率和穩定性的驗證。

2 結果

2.1 系統適用性試驗

分別取空白肝微粒體、空白肝微粒體加對硝基酚和非那西丁,空白肝微粒體加對乙酰氨基酚和咖啡因,參照“1.4”和“1.5”項方法處理和分析樣品。在此條件下,非那西丁和對硝基酚的保留時間分別為7.8 min和10.4 min,理論塔板數均大于13 000；對乙酰氨基酚和咖啡因的保留時間分別為5.8 min和8.5 min,理論塔板數均大于11 000。兩組方法中各成分達基線分離,內源性物質無干擾(見圖1)。

2.2 標準曲線的繪制

分別取對硝基酚和對乙酰氨基酚系列標準溶液各50 μL,揮干溶劑后,加入肝微粒溶液,每個濃度樣品一式3份,參照“1.4”和“1.5”項方法處理和分析樣品。以各底物峰面積與內標峰面積之比作為縱坐標(Y),以各底物濃度作為橫坐標(X)進行線性回歸。同時以信噪比≥10計算定量下限(LLOQ)。結果顯示:對硝基酚和對乙酰氨基酚在0.5～100 μmol/L范圍內線性關系良好,回歸方程分別是Y=0.0107X+0.0055和Y=0.0216X+0.0042；相關系數依次是0.9999和0.9993；LLOQ均為0.5 μmol/L。

2.3 精密度和回收率試驗

制備高、中、低3個濃度的對硝基酚、對乙酰氨基酚質控樣品,每一濃度平行制備5份,參照“1.4”和“1.5”項方法,1 d內進樣分析,記錄色譜,計算日內精密度,連續測定3 d,計算日間精密度。將檢測得到的底物與內標峰面積之比代入回歸方程,計算方法回收率。再取同等濃度的各底物和內標對照品溶液,直接揮干溶劑,流動相溶解后進樣分析,記錄色譜,將肝微粒體內的底物的標峰面積與對照峰面積進行比較,計算提取回收率(見表1)。

表1 精密度和回收率試驗結果(n=5)

2.4 穩定性試驗

分別將低、中、高3個濃度的對硝基酚、對乙酰氨基酚質控樣品置于室溫和-20 ℃冰箱中保存。置于室溫的樣品分別于24 h和48 h后進行測定。置于-20 ℃冰箱中的樣品分別于3 d和7 d后測定。結果顯示:置于室溫的對硝基酚和對乙酰氨基酚的測定結果RSD%<3.2%和RSD<4.8%；置于冰箱的測定結果RSD%<7.6%和RSD%<9.3%。表明兩組質控樣品在室溫48 h內穩定,在-20 ℃冰箱7 d內穩定。

圖1 HPLC圖A.對硝基酚組的空白肝微粒體;B. 空白肝微粒體加對硝基酚和非那西丁;C. 對乙酰氨基酚組的空白肝微粒體;D. 空白肝微粒體加對乙酰氨基酚和咖啡因1. 非那西丁(內標)；2. 對硝基酚; 3. 對乙酰氨基酚； 4. 咖啡因(內標)

3 討論

本試驗對色譜條件進行了篩選,比較了甲醇、乙腈和不同pH緩沖溶液的洗脫效果。結果發現：乙腈的洗脫能力較強,對硝基酚在pH5.0溶液、對乙酰氨基酚在水溶液中可以得到滿意的分離效果。試驗還比較了乙腈直接沉淀蛋白、氯仿-乙酸乙酯(3∶2)萃取、乙醚萃取、乙酸乙酯萃取幾種前處理方法。結果顯示：氯仿-乙酸乙酯和乙醚的提取率很低(<50%),而乙腈和乙酸乙酯提取率較高?？紤]到經乙酸乙酯萃取,體系中的雜質較少,去除蛋白效果好,故選擇乙酸乙酯作為提取試劑。

目前UGT酶活性的測定方法主要有放射檢測法、紫外法、熒光法和LC-MS法等。放射檢測法以14C-二磷酸尿苷葡萄糖醛酸作為酶底物, 以放射自顯影術測定酶活性,該方法底物較為昂貴,測定周期長,技術不易普及[6]；紫外法主要以2-氨基酚為底物,利用重氮化偶合反應測定UGT總酶的活性,該方法操作過程極為煩瑣,且檢測準確度較低[7]；熒光法主要以熒光試劑作為底物(如對羥基聯苯、7-羥基-4-甲基香豆素),方法雖然簡單,但易受干擾[8,9]；有學者[10]以丙泊酚為底物,利用LC-MS法測定UGT1A9酶活性,該法靈敏度高、準確性和專屬性較好,但丙泊酚是一種靜脈麻醉藥,屬于管制藥品,不易獲得。與其他方法相比,本試驗選擇的UGT底物是常見的化學試劑,廉價、易獲得,其葡萄糖醛酸化反應專屬性較好。兩組方法前處理簡單、測定技術普及率高、方法靈敏、定量準確、專屬性好,故可以為UGT酶活性測定提供有效的分析方法。

參考文獻

[1] 金蕾,楊麗杰,陳巖. 尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶基因多態性對藥物代謝影響的研究進展[J]. 中國藥師,2013,16(1)：33-36.

[2] Court MH. Isoform-selective probe substrates for in vitro studies of human UDP-glucuronosyltransferases [J]. Methods in Enzymology,2005,400(2)：104-116.

[3] Alison MM, Brian B, Michael WH. A Novel Method for the Immunoquantification of UDP-Glucuronosyltransferases in Human Tissue [J]. Drug Metabolism and Disposition, 2011,39(12):2258-2263.

[4] Miners JO, Bowalgaha K, Elliot DJ,etal. Characterization of Niflumic Acid as a Selective Inhibitor of Human Liver Microsomal UDP-Glucuronosyltransferase 1A9: Application to the Reaction Phenotyping of Acetaminophen Glucuronidation[J]. Drug Metabolism and Disposition, 2011, 39(4):644-652.

[5] 代晶,楊萬清,廖林川. 氯胺酮多次給藥對大鼠肝微粒體內細胞色素P450_2B酶的誘導作用[J]. 成都醫學院學報,2012,79(3)：383-385.

[6] 陳霞,何念海．放射測定胎鼠肝臟尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶 1A1活性[J]. 中國新生兒科,2006,21(4)：204-206.

[7] 石衛州,程允相,樊星花,等. 桂郁金水提物對大鼠肝胞漿和微粒體內II 相脫毒酶的影響[J]. 中國實驗方劑學雜志,2013,19(8):163-166.

[8] 張翠麗. 大蒜油對二乙基亞硝胺誘發肝癌的預防作用及機制研究[D].濟南:山東大學,2012:63-64.

[9] Yuji I, Hiroki K, Kousuke K. Alteration of the Function of the UDP-Glucuronosyltransferase 1A Subfamily by Cytochrome P450 3A4: Different Susceptibility for UGT Isoforms and UGT1A1/7 Variants[J]. Drug Metabolism and Disposition,2014, 42(2): 229-238.

[10] Su J, He YQ, Wang CH,etal. Interspecific difference Assay of UDP-glucuronosyltransferase 1A9 activities in liver microsomes by ultra-performance liquid chromatography-tandem Mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Natural Medicines,2010,8(1)：34-39.

Determination of UGT Substrates in Rats' Liver Microsomes by HPLC

HONGLi-xia,LVHong-xia,SHIMing-xin,WANGJia-hui,DAIJing*

(SchoolofPharmacy,ChengduMedicalCollege,Chengdu610083,China)

Objective To establish a HPLC method for the determination of UGT substrates in isolated rat liver microsomes. Methods P-nitrophenol and acetaminophen were chosen as UGT substrates, with phenacetin and caffeine as internal standards, respectively. The determination was performed on a Welchrom C18 column, with mobile phase of p-nitrophenol was acetonitrile-0.01mol/L ammonium acetate (pH 5.00=35∶65，and for acetaminophen was acetonitrile -water=14∶86. The flow rate was 1 mL/min. Detection wavelength of p-nitrophenol and acetaminophen were set at 316 nm and 244 nm. The column temperature was 30 ℃, and injection volume was 20 μL. Results The linear ranges of p-nitrophenol and acetaminophen were 0.5-100 μmol/L. The intra-and inter-assay precisions of p-nitrophenol were less than 14.7%，the assay recoveries were between 89.9% and 111.0%, and the extract recoveries were greater than 86.5%. For acetaminophen, the intra-and inter-assay precisions were less than 13.0%, the method recoveries were between 105.6% and 114.2%, and extraction recovery was greater than 78.3%. Conclusion The two methods were sensitive, simple and accurate. which can be applied for determination of UGT enzyme activity in isolated rat liver microsome.

HPLC; Uridine Diphosphate Glucuronosyltransferase; P-Nitrophenol; Acetaminophen; Liver Microsomes

國家級大學生創新創業訓練計劃項目(NO：20133705006)；四川省教育廳理科重點項目(NO：12ZA026)；成都醫學院大學生創新性實驗項目(NO：CX201103)

代晶,E-mail：daijing320@126.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20140417.1420.003.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2014.02.003

R969.2

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