抗雙鏈DNA抗體檢測策略研究

譚太昌,王婷,張航烽*,龍武彬(.四川省醫學科學院·四川省人民醫院檢驗科,成都 6007；.瀘州醫學院,瀘州 646000；. 四川省醫學科學院·四川省人民醫院風濕免疫科,成都 6007)

·論 著·

抗雙鏈DNA抗體檢測策略研究

譚太昌1,王婷2,張航烽1*,龍武彬3
(1.四川省醫學科學院·四川省人民醫院檢驗科,成都 610072；2.瀘州醫學院,瀘州 646000；3. 四川省醫學科學院·四川省人民醫院風濕免疫科,成都 610072)

目的 研究臨床檢測抗雙鏈DNA抗體(anti-dsDNA)的最佳檢測方案。方法 將60例系統性紅斑狼瘡(SLE)血清,30例其他疾病對照組(ODC)血清和30例正常對照組(NC)血清樣本同時進行線性免疫印跡法(LIA),綠蠅短膜蟲間接免疫熒光實驗(CLIFT),鮭魚精子純化抗原酶聯免疫吸附實驗(ELISA-Ⅰ)和胎牛胸腺純化抗原酶聯免疫吸附實驗(ELISA-Ⅱ),檢測血清標本中的anti-dsDNA。結果 LIA檢測anti-dsDNA靈敏度為58.33%,CLIFT為56.67%,ELISA-Ⅰ51.67%, ELISA-Ⅱ73.33%； 特異性分別為： LIA 71.67%,CLIFT 100.00%, ELISA-Ⅰ 93.33%,ELISA-Ⅱ 86.67%。ELISA-Ⅰ與LIA、CLIFT比較,檢測結果差異無統計學意義(P>0.05)；ELISA-Ⅱ與LIA、CLIFT、ELISA-Ⅰ比較,檢測結果差異具有統計學意義(P<0.01)。ROC分析顯示ELISA-Ⅰ、ELISA-Ⅱ 曲線下面積(AUC)分別為0.764和0.882(P<0.01);如采用ROC曲線的截斷點(cut-off point), ELISA-Ⅰ的靈敏度和特異性為55.00%和91.67%,ELISA-Ⅱ為81.67%和83.33%；根據ROC曲線將特異性設置為95.00%時,ELISA-Ⅰ和ELISA-Ⅱ的靈敏度分別降低到48.33%和50.00%。結論 4種不同的anti-dsDNA檢測試劑盒顯示出不同的檢測性能。CLIFT和ELISA均可用于anti-dsDNA的常規檢測,由于ELISA具有良好的靈敏度,因此可作為anti-dsDNA的篩查實驗；而CLIFT特異性最佳,可作為確證實驗。無論臨床實驗室采取何種檢測方法,針對anti-dsDNA的陽性檢測結果,實驗室工作人員應與臨床醫生始終保持足夠的聯系和溝通,并意識到臨床實驗室選擇不同anti-dsDNA檢測方法的靈敏度和特異性差異問題。

抗雙鏈DNA抗體；系統性紅斑狼瘡；間接免疫熒光法；酶聯免疫吸附實驗；免疫印跡法

抗雙鏈DNA抗體(anti-dsDNA)是系統性紅斑狼瘡(SLE)的血清學標志物,而且是臨床上最常進行的一項實驗檢測指標[1]。SLE是一種常見的、累及全身的自身免疫性疾病,中華醫學會風濕病學分會在SLE診斷及治療指南[2]中指出,SLE的anti-dsDNA特異性為95%,敏感性為70%,但該診療指南并未對檢測方法進行限定。正是由于不同的檢測方法和不同的試劑會對結果產生不同影響,目前anti-dsDNA的檢測沒有一個規范的方法和流程,各種方法和試劑檢測結果之間的差異懸殊,如何在現有條件下使用合適的檢測方法,最終為臨床診斷提供更有價值的實驗室診斷結果是亟需解決的問題。目前檢測anti-dsDNA的方法主要有綠蠅短膜蟲間接免疫熒光實驗(CLIFT)、酶聯免疫吸附實驗(ELISA)、線性免疫印跡法(LIA)等。本研究旨在通過對常用實驗方法進行對比,評價出能更好檢測血清中anti-dsDNA的方法,以期找到一種在臨床上檢測anti-dsDNA的最佳方案。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2013年6～12月就診于四川省人民醫院申請抗核抗體譜檢測的臨床住院患者標本90例,其中男15例,年齡19～47歲；女75例,年齡14～82歲。確診SLE患者60例,其他疾病組(ODC)患者30例(包括干燥綜合征4例,混合性結締組織病5例,類風濕性關節炎5例,感染性疾病10例,心血管疾病6例),自身免疫性疾病(AID)患者的診斷均符合國際相關學會的診療指南。健康對照組(NC)30例(均無肝、腎病史及結締組織病史),其中男10例,女20例,年齡19～41歲。送檢樣本均為待測患者清晨空腹靜脈血,離心10 min(3 000 r/min)后分離血清在24 h內使用LIA方法進行抗核抗體譜(包括anti-dsDNA)檢測,留取血清樣本保存于-80 ℃,統一采用CLIFT和ELISA方法檢測anti-dsDNA。

1.2 研究方法

1.2.1 LIA檢測anti-dsDNA 采用德國歐蒙公司提供的抗核抗體譜(IgG)免疫印跡法檢測,該試劑盒是將經親和層析提純的雙鏈DNA(dsDNA)等抗原線性包被于硝酸纖維素膜上并經封閉處理,與待檢血清中的自身抗體反應后,加入酶標記的抗人IgG,再加入底物顯色,陽性結果在相應的位置出現棕色條帶。實驗操作嚴格按照說明書進行。

1.2.2 CLIFT檢測anti-dsDNA 采用德國歐蒙公司提供的anti-dsDNAIgG檢測試劑盒(間接免疫熒光法)檢測。該試劑盒是將包被有綠蠅短膜蟲的生物薄片和稀釋的血清樣本溫育。如果樣本是陽性,特異性IgG、IgA和IgM抗體與鞭毛蟲抗原結合。在第2次溫育時,熒光素標記的抗人IgG抗體與結合在生物基質上的抗體反應,形成熒光顯微鏡下所觀察到的特異性熒光模式。實驗操作嚴格按照說明書進行。

1.2.3 ELISA-Ⅰ 采用德國歐蒙公司提供的anti-dsDNAIgG檢測試劑盒(酶聯免疫吸附法)檢測。該試劑盒中微孔里包被的是由鮭魚精子中高度純化的天然dsDNA和重組dsDNA。第1次溫育時,稀釋后的樣本在微孔中反應,如果樣本陽性,特異性IgG抗體(包括IgA和IgM)與抗原結合；然后加入酶標記的IgG(酶結合物)進行第2次溫育；最后加入酶底物,發生顏色反應。實驗操作嚴格按照說明書進行。

1.2.4 ELISA-II 采用蘇州浩歐博生物醫藥有限公司(HOB)提供的anti-dsDNA高親和力抗體IgG檢測試劑盒(酶聯免疫吸附法)檢測。該試劑盒是通過將稀釋后的血清樣本加入包被有從胎牛胸腺中純化的天然dsDNA的微孔板中進行溫育。洗去未結合的血清成分后,在反應孔中加入辣根過氧化物酶標記兔抗人抗體(IgG),與表面結合的抗體進行第2次溫育,洗去未結合的組分,加入TMB底物,底物在酶的催化下產生顏色反應。加入終止液終止反應,在450/630 nm 波長下用酶標儀測定吸光度。吸光度與樣品anti-dsDNA高親和力抗體的濃度成比例關系。實驗操作嚴格按照說明書進行。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件進行數據處理。率的比較采用χ2檢驗,方法一致性比較采用Kappa檢驗, MedCalc 11.4.2.0用于ROC曲線分析,P<0.05為差異有統計學意義。

1.4 性能指標

4種方法檢測anti-dsDNA抗體的檢測特性(來源于試劑盒說明書)(見表1)。

表1 4種檢測方法的主要性能指標

2 結果

2.1 根據制造商建議臨界值(cut-off)對4種方法檢測不同組別血清anti-dsDNA的靈敏度和特異性分析

根據制造商建議的臨界值(cut-off),對4種方法檢測不同組別血清anti-dsDNA的結果進行分析處理并計算靈敏度和特異性。結果顯示,4種方法檢測anti-dsDNA,除CLIFT的特異性外,其余與生產廠商說明的靈敏度和特異性都有較大的差別(見表1)。ELISA-Ⅰ和ELISA-II結果按照制造商說明以定性結果與其他方法比較。ELISA-Ⅰ和LIA、CLIFT之間比較,差異無統計學意義(P>0.05)；ELISA-II與LIA、CLIFT、 ELISA-I之間比較,差異有統計學意義(P<0.01)(見表2)。

表2 根據廠家建議cut-off值4種方法檢測anti-dsDNA的靈敏度及特異性

與LIA,CLIFT, ELISA-I之間比較,*P<0.01

2.2 方法間的一致性比較分析

應用Kappa檢驗來分析方法間檢測結果的一致性,一般認為,Kappa值在0.410～0.600之間表示中等程度相關,0.610～0.800表示較高程度相關,0.810～1.000表示高度相關,4種方法間的一致性比較結果(見表3)。

表3 方法間的一致性比較結果

2.3 兩種ELISA方法檢測結果分布圖

兩種ELISA方法檢測anti-dsDNA結果分布圖(見圖1、圖2)。

圖1 ELISA-Ⅰ檢測結果分布圖

2.4 兩種ELISA方法檢測anti-dsDNA的ROC曲線分析

ROC曲線是一種全面、準確評價診斷試驗的工具,ROC曲線下面積(area under the ROC curve, AUC)是反映診斷試驗準確性的關鍵指標,通常認為其取值在0.70～0.90時具有中等的診斷準確性,兩種ELISA檢測anti-dsDNA的ROC曲線分析可見,ELISA-Ⅰ的AUC為0.764,ELISA-II的AUC為0.882,ELISA-Ⅰ的最佳截斷點(cut-off point)為79.361,ELISA-II的cut-off point為47.108(見圖3)。

圖2 EITSA-II檢測結果分布圖

圖3 ELISA-Ⅰ和ELISA-II的ROC曲線

2.5 根據ROC曲線分析得出的cut-off point,ELISA-Ⅰ和ELISA-II檢測anti-dsDNA靈敏度和特異性分析

根據ROC曲線分析得出的cut-off point,對兩種ELISA方法檢測不同組別血清anti-dsDNA的結果進行分析處理并計算靈敏度和特異性,可看出靈敏度有所提高,同時特異性有所降低(見表4)。

2.6 根據ROC曲線將特異性設為95%時ELISA-Ⅰ和ELISA-II檢測anti-dsDNA靈敏度分析

根據ROC曲線將分析特異性設為95%時,對兩種ELISA方法檢測不同組別血清anti-dsDNA的結果進行分析處理并計算靈敏度,可看出隨著特異性提高,兩種ELISA方法檢測anti-dsDNA的靈敏度都有很大程度下降(見表5)。

表4 根據ROC曲線分析得出的cut-off point,ELISA-Ⅰ和ELISA-II檢測anti-dsDNA的靈敏度及特異性

表5 根據ROC曲線將特異性設置為95.00%時ELISA-Ⅰ和ELISA-II檢測anti-dsDNA的靈敏度及特異性

3 討論

SLE是一種系統性自身免疫性疾病,患者血清中含有多種自身抗體[3]。SLE患者血清中存在一種能與天然脫氧核糖核酸(DNA)結合的成分,稱之為anti-dsDNA。anti-dsDNA與SLE高度相關,是SLE的特異性抗體之一,也是SLE的重要診斷依據之一[4,5]。目前臨床應用于檢測anti-dsDNA的方法各有利弊。放射免疫(Farr)檢測anti-dsDNA出現最早,具有只結合高親和力抗體的獨特優勢,特異性好,曾被列為檢測anti-dsDNA的金標準。但其缺點是有放射性、檢測周期長、易受到血清中高親和力IgM的干擾、且不能自動化,現在臨床實驗室中已經很少采用[6,7]。故本研究未選擇該方法。

本研究采用的LIA檢測anti-dsDNA,該實驗在SLE患者中陽性率為58.33%,在ODC組中陽性率為50.00%,NC組中陽性率為6.67%,對SLE的診斷特異性為71.67%,為4種方法中最低。由于其抗原是包被在膜條上面,溫度、濕度等因素均可影響檢測結果,故敏感性較低,特異性也不夠。CLIFT使用的是綠蠅短膜蟲天然DNA(dsDNA,nDNA)來檢測anti-dsDNA。綠蠅短膜蟲動基體內只含有ds DNA,而不含有其它人細胞核成分抗原,因此和動基體反應的抗核抗體必然是anti-dsDNA,其具有高度特異性。本研究中該實驗在SLE患者中的檢測靈敏度為56.67%,但其特異性為100.00%,可見CLIFT是對SLE高度特異的診斷實驗。ELISA-I使用的是歐蒙公司提供的酶聯免疫吸附試劑盒,本研究中該實驗在SLE患者中的靈敏度為51.67%,在ODC組中的陽性率為10.00%,在NC組的陽性率為3.33%,特異性為93.33%。 ELISA-II是使用的蘇州 HOB公司提供的酶聯免疫吸附試劑盒,本研究中該實驗在SLE患者中的靈敏度為73.33%,在ODC組中的陽性率為23.33%,在NC組中陽性率為3.33%,特異性為86.67%。可以觀察到：4種方法檢測anti-dsDNA的靈敏度和特異性與制造商的說明都有較大差別。

從表3可以看出,4種檢測anti-dsDNA的方法間都具有中等程度以上的一致性(Kappa：0.545～0.677),相關性最低的是ELISA-I和ELISA-II之間,Kappa為0.545。本研究中,ELISA-Ⅰ與LIA、CLIFT之間比較檢測結果,差異無統計學意義(P>0.05);但ELISA-Ⅱ與LIA、CLIFT、ELISA-Ⅰ之間比較檢測結果,差異均具有統計學意義(P<0.01)。Pisetsky[1]在其綜述中指出,DNA的構象、來源、堿基組成、大小、流動性以及固相和液相都會對anti-dsDNA的檢測有很大影響。在一些有關方法學比較的文獻[8,9]中可看出,anti-dsDNA的檢測因為試劑盒中抗原的來源不同而引起靈敏度和特異性的差異,直接導致檢測結果的一致性偏低。本研究中4種方法所用靶抗原來源均不相同,因此,實驗所造成的差異大多來源于此。LIA是將抗原直接包被在膜條上的一種檢測anti-dsDNA的實驗,在本研究中其靈敏度與其它3種方法接近,但特異性不夠,本研究中為71.67%,在其它疾病患者血清中亦可查見,這與Yang等[10]的研究結果一致。考慮到其特異性不夠,故臨床應用時只能作參考,尚不能滿足臨床診斷的需要。CLIFT以綠蠅短膜蟲蟲體為包被基質,其上只含有一個單純的、完整的dsDNA分子,不含有任何其他物質,特異性好；由于只結合血清中的高親和力抗體,故靈敏度有一定限制。本研究可觀察到,在60例SLE血清中,ELISA-II檢測為陽性的樣本有16.67%用CLIFT檢測為陰性,Antico等[6]在相關的研究中也證明了這一點。由于其高度的特異性,CLIFT方法可以用做anti-dsDNA檢測的確證實驗。ELISA-Ⅰ和ELISA-II的靶抗原分別為從鮭魚精子、胎牛胸腺中提取的天然dsDNA,其缺點在于提取純化過程中容易受到污染而影響特異性,但其成本低廉、操作簡便,易于在實驗室展開,本研究中可觀察到兩種ELISA方法都具有較高的靈敏度和特異性,可用做anti-dsDNA檢測的篩查實驗。

從ROC曲線分析可以看出,ELISA-I的AUC為0.764,ELISA-II的AUC為0.882,說明兩種ELISA方法用于anti-dsDNA的檢測都有一定準確性,但由于抗原來源不同,檢測結果差異有統計學意義(P<0.01)。當采用ROC曲線給出的cut-off point時,ELISA-I的靈敏度提高到55.00%,但其特異性降低到91.67%；ELISA-II的靈敏度提高到81.67%,但其特異性降到83.33%。如果將兩種方法的特異性都設置為95.00%,可以看到靈敏度分別降到48.33%和50.00%。所以,各個實驗室應該根據實驗的用途通過大樣本的ROC曲線分析,使用合適的cut-off point值。

綜上所述,4種anti-dsDNA的檢測試劑由于靶抗原和檢測方法的不同,因而檢測結果也不盡相同。考慮到LIA較低的靈敏度和特異性,不推薦用于anti-dsDNA的檢測。ELISA-Ⅰ和ELISA-II由于其簡便的操作、較好的靈敏度和特異性,用做anti-dsDNA的篩查時可以任選1個或者同時選擇兩種不同抗原來源的ELISA方法來做篩查,以減少誤差。CLIFT雖然靈敏度不如新一代ELISA,由于其檢測結果對SLE的高度特異性,可以用做anti-dsDNA的確證實驗。Antico 等[6]經過多中心的研究后提出,新一代酶免分析檢測anti-dsDNA可以替代Farr和CLIFT方法,Haque[11]以及Andrejevic等[12]在研究中也指出,ELISA檢測anti-dsDNA是敏感的診斷工具,但本研究觀察到,在特異性上ELISA檢測anti-dsDNA明顯低于CLIFT。根據本研究結果建議,鑒于ELISA法操作簡便、易于自動化、可定量、高通量,并具有良好的靈敏度,因此可作為anti-dsDNA的篩查實驗,而CLIFT特異性最佳,可作為確證實驗。無論臨床實驗室采取何種檢測方法,針對anti-dsDNA的陽性檢測結果,實驗室工作人員應與臨床醫生始終保持足夠的聯系和溝通,并意識到臨床實驗室選擇不同anti-dsDNA檢測方法的靈敏度和特異性差異問題。

[1] Pisetsky DS. Standardization of anti-DNA antibody assays[J]. Immunologic Research, 2013, 56(2-3): 420-424.

[2] 中華醫學會風濕病學分會.系統性紅斑狼瘡診斷及治療指南[J].中華風濕病學雜志,2010,5(14)：342-348.

[3] Ahearn JM, Liu CC, Kao AH,etal. Biomarkers for systemic lupus erythematosus[J]. Translational Research, 2012, 159(4): 326-342.

[4] Srdic-Rajic T, Jurisic V, Andrejevic S,etal. Naturally occurring V region connected antibodies inhibit anti-dsDNA antibody reactivity with dsDNA[J]. Immunobiology, 2012, 217(1): 111-117.

[5] 武建國. SLE 和類風濕關節炎的新分類標準[J]. 臨床檢驗雜志,2013, 31(7): 481-483.

[6] Antico A, Platzgummer S, Bassetti D,etal. Diagnosing systemic lupus erythematosus: new-generation immunoassays for measurement of anti-dsDNA antibodies are an effective alternative to the Farr technique and the Crithidia luciliae immunofluorescence test[J]. Lupus, 2010, 19(8): 906-912.

[7] Hillebrand JJ, Moens HJ, Mulder AH. Changes in Farr radioimmunoassay and EliA fluorescence immunoassay anti-dsDNA in relation to exacerbation of SLE[J]. Lupus, 2013, 22(11): 1169-1173.

[8] 陳熙, 胡祎明, 閆伯英, 等. 3 種檢測抗雙鏈 DNA 抗體方法的結果比對分析[J]. 臨床檢驗雜志,2013, 31(8): 573-574.

[9] Venner AA, Ibaez D, Gladman DD,etal. Comparison of three anti-dsDNA assays: Performance and correlation with systemic lupus erythematosus disease activity[J]. Clinical Biochemistry, 2013, 46(4): 317-320.

[10] Yang J, Oh EJ, Kim Y,etal. Evaluation of Anti-dsDNA antibody tests: Crithidia luciliae immunofluorescence test, immunoblot, enzyme-linked immunosorbent assay, chemiluminescence immunoassay[J]. The Korean Journal of Laboratory Medicine, 2010, 30(6): 675-684.

[11] Haque SF. Anti-double stranded DNA antibodies are valuable markers of disease activity in Systemic Autoimmune disorders[J]. Novel Science International Journal of Medical Sciences, 2012, 1(1)：1-6.

[12] Andrejevic S, Jeremic I, Sefik-Bukilica M,etal. Immunoserological parameters in SLE: high-avidity anti-dsDNA detected by ELISA are the most closely associated with the disease activity[J]. Clinical Rheumatology, 2013, 32(11): 1619-1626.

Study on Anti-dsDNA Antibody Detection Strategies

TANTai-chang1,WANGTing2,ZHANGHang-feng1*,LONGWu-bin3

(1.DepartmentofMedicalLaboratory,SichuanAcademyofMedicalScience&SichuanProvincialPeople'sHospital,Chengdu610072,China; 2.LuzhouMedicalCollege,Luzhou646000,China; 3.DepartmentofRheumatologyandImmunology,SichuanAcademyofMedicalScience&SichuanProvincialPeople'sHospital,Chengdu610072,China)

Objective To look for the optimum solution of anti-double-stranded-DNA (anti-dsDNA) antibodies detection. Methods To address the test feature of anti-dsDNA antibodies detection by different test methods, the performances of four immunoassays were compared. These included Line Immunoassay (LIA), crithidia Luciliae Immunofluorescence test (CLIFT) and two enzyme-linked immunoassays (ELISA). The sample set included 60 sera from systemic lupus erythematosus (SLE); 30 from other diseases (ODC) and 30 from the normal control group(NC). Results The sensitivity and specificity of these four assays were 58.33% and 71.67% (LIA),56.67% and 100.00% (CLIFT), 51.67% and 93.33% ( ELISA-Ⅰ), 73.33% and 86.67% ( ELISA-Ⅱ) respectively. There were no significant differences among LIA, CLIFT and ELISA-Ⅰ (P>0.05), but ELISA- Ⅱ showed the highest sensitivity (P<0.01). In ROC curve analysis, ELISA-Ⅰand ELISA- Ⅱshowed AUC values of 0.764 and 0.882. When calculated by using the cut-off point of ROC curve, the sensitivity and specificity of ELISA-Ⅰwere 55.00% and 91.67%; ELISA-Ⅱ were 81.67% and 83.33%. When evaluated by increasing the specificity values to 95.00%, the sensitivity of ELISA-Ⅰdecreased to 48.33%, ELISA- Ⅱ to 50.00%. Conclusion Four different assays showed various test features. Both CLIFT and ELISA are suitable for the routine test of anti-dsDNA antibodies in clinical laboratory. Due to the fact that ELISA showed the highest sensitivity, it can be used for screening purpose,CLIFT had the highest specificity, and can be used as a confirmation test. Regardless of the testing strategy among individual laboratories, clear communication with the clinical staff regarding the significance of a positive result is imperative. The laboratory and the clinician must both be aware of the sensitivity and specificity of each testing method used in the clinical laboratory.

Anti-Double-Stranded DNA Antibocly; Systemic Lupus Erythematosus; Indirect Immunofluorescence Assay; Enzyme-Linked Immunosorbent Assay; Immunoblotting Assay

中國高校醫學期刊臨床專項資金(NO:11321500)

張航烽,E-mail:sinotan@sina.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20140415.1045.002.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2014.02.006

R446.6

A