成纖維樣滑膜細胞Toll樣受體在類風濕性關節炎的研究進展

唐媚,胡松,唐信威,劉陽,王衍堂,鄒強*(.遵義醫學院免疫學教研室,遵義 563003；.成都醫學院免疫學教研室,成都 60083)

·綜 述·

成纖維樣滑膜細胞Toll樣受體在類風濕性關節炎的研究進展

唐媚1,胡松2,唐信威2,劉陽2,王衍堂2,鄒強2*
(1.遵義醫學院免疫學教研室,遵義 563003；2.成都醫學院免疫學教研室,成都 610083)

類風濕性關節炎；Toll樣受體；成纖維樣滑膜細胞

Toll樣受體(toll-like receptor, TLRs)是一種I型跨膜蛋白受體,可識別微生物上特定結構的病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)和宿主自身損傷細胞產生的損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMPs),在天然免疫中發揮著重要作用。類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是以關節滑膜炎為主要特征的自身免疫性疾病。成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes, FLSs)異常增生及分泌炎性細胞因子,最終可致關節慢性炎癥和畸形[1]。FLSs是滑膜組織的重要組成成分之一,巨噬樣滑膜細胞活化后分泌的細胞因子如IL-1β可誘導FLSs增殖,隨后增生活化的FLSs一方面分泌趨化因子、炎性細胞因子引起關節炎癥,另一方面FLSs分泌基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)侵蝕軟骨,引起關節畸形,從而在RA的病理機制中發揮著至關重要的作用[2]。FLSs上表達的TLRs活化后,會激活下游一系列的信號轉導通路,啟動炎性細胞因子、趨化因子以及MMPs的表達,在RA發病進程中扮演了重要角色。為此,對TLRs在免疫反應中的調節作用及其胞內信號轉導激活機制的研究將為RA治療提供新思路[3]。

1 TLRs結構、信號通路及配體

TLRs的發現是近十余年天然免疫系統研究中最主要的進展之一。它主要由3個功能區構成:胞外區、跨膜區和胞內區。其胞外區有19～25個富含亮氨酸的重復序列,此結構能促進蛋白質間的相互黏附,有利于識別病原體及其產物,不同的TLRs胞外區同源性較低,可能與其識別不同結構的配體相關[2]。TLRs的跨膜區富含半胱氨酸。TLRs的胞內區與白細胞介素1受體(interleukin-1 receptor, IL-1R)的胞內區結構相似,為TIR(Toll IL-1R)同源區,它是Toll蛋白和IL-1R向下游轉導信號的核心元件。不同的TLRs通過特異性識別一類PAMPs,如病毒、細菌和真菌；或來源于宿主自身損傷細胞產生DAMPs[4],如熱休克蛋白,介導胞內信號轉導,從而釋放促炎因子、趨化因子,誘導T淋巴細胞產生適應性免疫反應。

TLRs家族信號通路包括髓樣分化蛋白88(myeloid differentiation primary response protein 88, MyD88)依賴性傳導途徑和MyD88非依賴性傳導途徑兩種(見圖1)。在MyD88依賴性傳導途徑中,TLRs胞內區域與MyD88羧基端的TIR結構域相結合而激活MyD88。MyD88的DD結構域與IL-1R相關激酶(IL-1R-associated kinases, IRAKs)的氨基端死亡區域相互作用,招募IRAKs到TLRs信號復合物上引起IRAKs自身磷酸化[5]。隨之,再與腫瘤壞死因子受體相關因子6(tumor necrosis factor receptor associates factor 6, TRAF6)結合[6],促使NF-κB抑制蛋白自身磷酸化,從而激活NF-κB使之從細胞質轉移到細胞核,最終輔助炎性細胞因子及刺激分子的轉錄、翻譯和表達。MyD88非依賴性傳導途徑是通過干擾素調節因子3(interferon regulatory factor 3, IRF3)和NF-κB的晚發活化實現。TLRs是通過β干擾素TIR結構域銜接蛋白(TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-β,TRIF)與TRIF連接,再與TRAF6結合：一方面激活IKKs復合體,使NF-κB抑制蛋白自身磷酸化,促使NF-κB從細胞質轉移到細胞核[7],并與DNA上NF-κB的位點結合,啟動轉錄調控機制；另一方面TRIF與TRF3結合,促使下游IRF3抑制蛋白自身磷酸化,隨后IRF3從細胞質轉移到細胞核內,啟動干擾素的表達。

TLRs作為連接天然免疫和適應性免疫的關鍵環節,在免疫應答中發揮著極為重要的作用。迄今已發現的人類TLRs有10種[8],在多種細胞中都有表達,其中包括上皮細胞、成纖維細胞、免疫細胞(單核細胞和巨噬細胞)和非免疫細胞(樹突細胞)等。現已發現的人關節滑膜細胞TLRs有6種(見表1),其中TLR1在細胞膜上表達,其配體是來源于細菌的三酰脂蛋白；TLR2在細胞膜上表達,其主要配體有脂蛋白、肽聚糖、HSP60、HSP70、Gp96、LDL和HMGB1；TLR3在溶酶體的內膜上表達,其主要配體有雙鏈RNA；TLR4在細胞膜上表達,其主要配體有脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、HSP60、HSP70、HSPB8和Gp96；TLR5在細胞膜上表達,其配體是來源于細菌的鞭毛蛋白；TLR6在細胞膜上表達,其配體是二酰基脂蛋白[8]。此外,FLSs上TLRs的表達和激活,對RA病理機制的研究有重要作用。

Ospelt等[9]在人滑膜細胞TLR(1-10)表達譜的研究中發現：TLR(1-6)的mRNA有表達,TLR(7-10)的mRNA無表達,其中TLR3的mRNA表達最高,TLR2、TLR4的mRNA表達稍弱,其他TLRs的mRNA的表達未能檢測出,提示TLR2、TLR3、TLR4對RA上FLSs的研究意義更為重大。為此,以下主要介紹FLSs上TLR2、TLR3、TLR4的配體種類、胞內信號傳導途徑以及目前的研究結果。

表1 人關節滑膜細胞上TLRs定位、配體及來源

圖1 人FLSs上TLRs信號傳導途徑

2 TLR2激活與RA的關系

TLR2是目前已克隆出的TLRs家族中識別病原微生物種類最多且表達范圍最廣的成員。TLR2主要通過識別特異性PAMPs來促發機體對病原微生物的級聯免疫反應,其配體有革蘭氏陽性菌的菌細胞壁組分,如胞壁酸、肽聚糖和細菌脂肽,革蘭氏陰性菌細胞壁的脂蛋白和脂肽聚糖,霉菌的細胞壁成分以及真菌的酵母聚糖等。其中,TLR2在識別細菌肽聚糖時,需要TLR1和TLR6協助識別酰化的脂肽[10]。新近研究[11]發現,TLR2還可識別組織損傷的DAMPs和某些內源性抗原,如熱休克蛋白和其他組織分泌的炎性因子。TLR2胞內信號傳導是通過MyD88依賴性傳導途徑完成的。TLR2與TLR1或TLR6結合形成的異源二聚體可識別特異性配體；活化的TLR2胞內,TIR與MyD88羧基端結合后募集MyD88到受體上,隨后MyD88利用N端的DD結構募集同樣含DD結構的IRAK-1和IRAK-4；IRAK-1被IRAK-4作用后磷酸化,并從受體復合體上解離且與TRAF6結合使之活化,最終促使NF-κB轉遷到核內,激活相應基因的轉錄[12]。

目前實驗研究結果[13]表明,FLSs上TLR2的激活與RA發病密切相關,其中主要表現在RA的促炎反應中。Schrijver等[14]在RA病人滑膜液中檢測到細菌的肽聚糖成分,提示TLR2可能參與RA的發病過程。Kyburz等[15]用TLR2配體刺激滑膜細胞,發現TLR2配體可促進滑膜細胞釋放結合素、MMP、IL-6和IL-8等促炎因子。在小鼠關節動物模型[16]中,小鼠關節注射TLR2配體(細菌肽聚糖)可形成嚴重的關節炎,表明在只有肽聚糖而無活菌的情況下,也可刺激關節產生炎癥反應。Pierer等[17]系統研究了RA病人滑膜細胞上TLR2介導的炎癥因子表達情況：通過TLR2配體(細菌肽聚糖)刺激滑膜細胞,建立體外模型篩選炎癥因子基因表達；利用高通量寡核苷酸微陣列對其技術分析發現,有74個基因表達增高,其中新發現了14個編碼化學增活素的基因；定量PCR檢測肽聚糖刺激后的正常人FLSs mRNA發現,粒細胞趨化蛋白2(granulocyte chemotactic protein2, GCP2)、T細胞激活分泌調節因子(RANTES)、單核細胞趨化蛋白2(monocyte chemoattractant protein2, MCP-2)、IL-8以及生長相關癌基因-2的表達均顯著升高,MCP-1、EXODUS、CXCL-16表達量也有所升高；同時,經刺激的細胞上清中也有GCP2、RANTES和MCP2的分泌,在RA病人的滑膜組織中也檢測到GCP2和MCP2,而在骨關節炎病人的滑膜組織中卻未檢測到。由此可見,TLR2配體通過刺激滑膜細胞活化釋放趨化因子,對RA的炎癥浸潤起了較大作用。

3 TLR3激活與RA的關系

TLR3是位于細胞內的模式識別受體(pattern recognition receptor, PRR),可識別病毒雙鏈RNA(dsRNA)。而宿主細胞本身不產生dsRNA,因此病毒在細胞內產生的dsRNA可被一種PAMPs識別。TLR3是唯一一種通過MyD88非依賴性傳導途徑進行信號傳導的TLRs。Brentano等[18]用TLR3配體poly(I∶C)刺激關節滑膜細胞,可檢測到炎性細胞因子和趨化因子,如IL-6、IFN-β、CCL5。RA病人壞死的滑膜細胞刺激FLSs,也可在上清中檢測到上述細胞因子,提示壞死的滑膜細胞RNA可能是由TLR3的內源性配體刺激FLSs促炎因子基因表達而形成。FLSs上TLR3受體的激活與RA炎癥的產生關系密切。Brentano等[18]用TLR3配體刺激RA和骨性關節炎(osseous arthritis, OA)病人的FLSs,發現RA滑膜細胞上TLR3的表達量高于OA。Roelofs等[19]發現RA病人滑膜組織上的TLR3受體比正常人表達量高。Ospelt等[9]研究顯示,早期RA病人滑膜細胞上TLR3表達量比持續期的表達量高。然而在FLSs上TLR3的炎性研究中出現了相互矛盾的實驗結果。 Zare等[20]發現正常小鼠關節在注射了dsRNA后會出現關節炎癥,但同樣的現象也出現在TLR3基因敲除小鼠上,這似乎無法解釋TLR3參與RA促炎的機制。然而隨后,Magnusson等[21]研究顯示,dsRNA刺激關節后是通過單核/巨噬細胞分泌IFN-α來引起關節炎癥反應的。Yarilina等[22]在血清和膠原抗體誘導的小鼠關節炎動物實驗研究[22]中發現,TLR3配體對關節炎癥有一定的抑制作用,表明FLSs上的TLR3介導了關節的抗炎反應。上述實驗結果說明,TLR3參與了RA病程發生發展過程,其中包括促炎和抗炎兩個方面,但TLR3在RA中介導炎癥反應的機制仍不清晰。

4 TLR4激活與RA的關系

TLR4是IL-1R家族的一員,是人類發現的首個TLRs相關蛋白,幾乎表達在所有細胞系上[23]。TLR4的配體種類繁多,按不同來源可分為內源性配體和外源性配體；其中內源性配體主要是因機體損傷、壞死或凋亡細胞釋放的熱休克蛋白、氧自由基和神經介質等,而外源性配體主要是LPS。TLR4胞內信號傳導包括MyD88依賴性傳導途徑和MyD88非依賴性傳導途徑兩種。

目前FLSs上TLR4在炎癥方面的研究結果相互對立,大部分集中在TLR4介導促炎反應方面。Roelofs等[19]在RA病人的滑膜液、血清中檢測到了高含量的TLR4配體,其中TLR4的內源性配體通過介導炎性細胞因子分泌來加重關節炎癥。同時,Ospelt等[9]發現,RA病人FLSs上TLR4的表達量升高,尤其在病程早期和持續期更為顯著。Nair等[24]通過RA和OA病人的滑膜液刺激體外培養的滑膜細胞,檢測到微量的IL-8；經LPS和滑膜液共同刺激滑膜細胞后發現IL-8分泌明顯升高。此外Nair等[24]實驗發現滑膜液中存在的可溶性CD14分子可增強TLR2和TLR4的表達。Lee等[25]在CII抗體誘導關節炎的小鼠動物模型中發現,TLR4基因敲除小鼠的關節腫脹程度,促炎因子COX-2、TNF-α的分泌量均低于野生型小鼠。同樣,在用免疫復合物誘導的小鼠關節炎模型(immune comlex-mediated arthritis,ICA)中發現,TLR4-/-小鼠關節腫脹程度輕于野生型小鼠,趨化因子以及IL-1、IL-6等促炎因子的分泌也明顯減少。然而,在含有沙眼衣原體滑膜細胞誘導的關節炎動物模型[26]中,發現TLR4基因缺陷小鼠的關節炎癥狀較正常組小鼠嚴重。TLR4受體激活后會加重IL-1引起的關節炎癥[27],而TLR4-/-小鼠可減輕因IL-1Ra基因缺失引起的關節炎癥狀[28],表明TLR4參與了抗炎反應。目前對TLR4配體存在、受體表達和發病機制的研究已較廣泛,但仍存在一些相互矛盾的實驗結果,說明現階段還不能透徹地認識TLR4參與RA發病的分子機制。由此猜想,TLR4介導促炎反應和抗炎反應是否與其存在兩條信號轉導途徑相關：MyD-88依賴性轉導途徑參與的促炎反應起著主要作用,而MyD88非依賴性轉導途徑參與的抗炎反應起著次要作用。

5 滑膜細胞上TLRs在RA靶向治療的應用

傳統的藥物和療法對RA病情的緩解有一定療效,但不能完全治愈。靶向關鍵細胞因子的生物制劑因價格昂貴、需反復注射和存在局部不良反應等缺陷,也無法滿足RA的治療需要,這使得探究治療RA的有效方法成為研究的熱點。研究結果[29]證實,TLRs在RA的發病機制中起著重要作用,因此靶向TLRs受體也成為RA的治療方法：阻斷TLRs下游信號介導蛋白質分子,采用中和抗體或可溶性假性抗體來阻斷TLRs配體和受體結合以抑制炎癥以及阻斷受體二聚化[30]等。

在抑制關節炎動物模型[31]中,輔助T細胞2表達的內毒素和肥大細胞表達的ST2蛋白可阻斷TLR4介導的信號傳導通路,從而減輕炎癥反應。SIGIRR可通過負向調控TLR4的信號傳導通路,來抑制RA病人FLSs產生炎性因子和細胞因子[32]。NovImmune公司研發的單克隆抗體NI0101/α可抑制TLR4激活,從而阻斷下游信號傳導[33]。烷酮衍生物、蘿卜硫素和OSL07可抑制TLR4二聚化從而阻斷下游信號[34]。Opsona公司研發的抗TLR2抗體、OPN-301可阻止RA病人體外培養的FLSs分泌炎性細胞因子。滑膜細胞上TLRs信號傳導途徑與RA的發生發展有必然聯系,因此,闡明靶向滑膜細胞上TLRs信號傳導途徑將為RA的治療提供新的思路。

6 展望

目前,臨床上傳統的RA治療方法存在諸多不足,迫切需要尋找新的有效療法。研究[29]發現,TLRs在RA的發病機制中發揮著至關重要的作用,主要表現在介導炎性介質生成和促進滑膜細胞增殖兩大方面。然而,目前對TLRs參與RA的分子機制及TLRs之間的相互影響仍無全面透徹的認識,希望在不久的將來能從多角度透徹研究TLRs和RA之間的關系,以便為RA的臨床治療提供新思路。

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國家自然基金資助項目(NO:81273530,81202363,81302786)

鄒強,E-mail：qiangzou99@gmail.com

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R392.9

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