分子標記技術的產生與引物設計

2014-08-12 18:44:10張羽

江蘇農業科學 2014年6期

關鍵詞：差異

摘要：基因組DNA堿基的轉換/顛換、插入/缺失及重排等變化會導致生物個體之間的差異，這種變化可能是發生在編碼區、非編碼區、內切酶識別序列、啟動子、調控序列等，由此產生了各類分子標記技術。筆者基于分子標記研究，從基因組堿基序列變化角度對各類分子標記產生的根源及引物設計等方面內容進行綜述，以期為更好掌握和運用分子標記提供參考。

關鍵詞：核苷酸；序列；差異；分子標記；引物設計

中圖分類號： Q78文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0047-05

收稿日期：2013-09-06

基金項目：陜西省農業科技創新項目（編號：NKC01-01）。

作者簡介：張羽（1968—），女，陜西漢中人，碩士，副教授，從事遺傳學理論與實踐等教學和科研工作。E-mail：zy68169@sina.com。生物的遺傳信息都蘊藏在堿基序列中，基因組堿基的轉換、顛換以及插入、缺失等變化會導致個體與個體之間的差異，即表現出生物的遺傳多樣性，這種特性既能傳遞又能以多種形式表現出來，這就是通常所說的遺傳標記。遺傳標記具有可遺傳性和可識別性，人們可以通過追蹤生物的性狀、染色體、染色體某一片段、蛋白質或DNA序列在家系中傳遞的規律和變化來研究生物的遺傳變異。因此，這種遺傳特性可以通過形態學、細胞學、生化及分子水平上的差異來表現，也就是說生物任何有差異表型的基因突變型均可作為遺傳標記。DNA 分子標記是以DNA分子的多態性為基礎的遺傳標記，它反映了生物個體或種群間基因組中某種差異特征的DNA 片段。與其他標記相比，DNA分子標記具有無可比擬的優越性：直接以DNA形式表現，既不受環境影響，也不受生物組織、發育時期影響；標記的數量多、多態性高；表現為中性，不影響目標性狀的表達；許多標記表現為共顯性，能區別純合體和雜合體；成本不太高等。目前主要有基于分子雜交的DNA標記技術和基于PCR的分子標記技術兩大類，基于分子雜交的DNA標記技術主要有限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphisms，RFLP）、可變數目串聯重復序列（variable number of tandem repeats，VNTR）、原位雜交（in situ hybridization，ISH）等；以PCR為核心的分子標記技術主要有隨機擴增多態性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、簡單序列重復（simple sequence repeat，SSR）、單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）等。

1第1代分子標記技術

1.1RFLP技術

1974年，RFLP技術第1次被用于遺傳分析[1-2]，它是一種以DNA-DNA雜交為基礎的第1代遺傳標記，是最早的DNA標記技術。RFLP技術的依據是限制性酶切位點上堿基的缺失/插入、重排和點突變而導致的基因型之間的限制性片段長度差異，利用特定的限制性內切酶識別并切割不同生物個體的基因組DNA。由于堿基組成不同，得到大小不等的酶切DNA片段，所產生的DNA數目和各個片段的長度反映了DNA分子上不同酶切位點的分布情況，再通過凝膠電泳形成不同帶型，最后用經標記的相應DNA探針與這些片段進行雜交，通過放射自顯影而顯示出的圖譜就可以反映出不同個體基因組DNA序列之間的差異。如圖1所示，個體a1、個體a2的基因組序列中有EcoRⅠ位點，但是由于堿基的插入/缺失，導致各自的EcoRⅠ酶切位點的位置不同。通過EcoRⅠ酶切后，個體a2除了形成與個體a1相同長度的片段外，還有一個長度不一的片段（比個體a1長約15 bp的片段）；由于個體a3在EcoRⅠ位點發生點突變，EcoRⅠ的酶切序列GAATTC變成了BamHⅠ的酶切序列GGATCC，因此用EcoRⅠ酶切，則產生不了片段，但用BamHⅠ酶切，個體a3出現條帶，而個體a1和個體a2不出現條帶。RFLP具有數目多、共顯性、不受環境影響、多態性高等特點，但RFLP技術對樣品要求高，DNA 必需是大分子，因此在抽提DNA過程中要避免DNA斷裂，限制性內切酶酶切消化要徹底；此外，制作雜交探針較困難，試驗操作較繁鎖，檢測周期長，成本費用高。

1.2VNTR技術

VNTR別稱小衛星DNA（minisatellite DNA），真核生物基因組中有2類可變的串聯重復序列，根據核心序列（重復序列）的長度分為小衛星和微衛星，其中小衛星重復單位的核心序列為15到幾十甚至幾百個核苷酸，一般位于基因組高變區，是基因組中的重組熱點，拷貝數達數百次不等，呈現出豐富的長度多態性[3-4]。VNTR技術的原理與RFLP技術大致相同，首先選擇在VNTR特異序列上的無酶切位點（保證小衛星序列的完整性）的限制性內切酶將總基因組DNA切成不同長度的片段，然后以VNTR中的特異序列為探針進行Southern雜交，放射自顯影后就可檢測到很多小衛星位點。如圖2所示，小衛星重復單位的核心序列為GGAGGTGGGCAGGAGG，在個體b1中核心序列重復了8次，記為（GGAGGTGGGCAGGAGG）8；個體b2中重復了7次，記為（GGAGGTGGGCAGGAGG）7；個體b3中核心序列重復了10次，記為（GGAGGTGGGCAGGAGG）10。因此，用VNTR標記就會形成3個不同長度的多態性，其中個體b2的擴增片段最短，個體b1比個體b2擴增片段長約16 bp的片段，個體b3比個體b2擴增出長約48 bp的片段。由此可以看出，VNTR數量有限，在基因組上分布不均勻；同時，VNTR技術具有試驗操作繁瑣、檢測時間長、成本高等缺點。

2第2代DNA分子標記技術

2.1RAPD技術

1990 年，Welsh等第1次提出RAPD[5-6]。RAPD技術是以基因組DNA為模板，以單個人工合成的隨機多態核苷酸序列為引物而進行的PCR 擴增技術。RAPD技術通常使用10個左右堿基的隨機單鏈引物，由于基因組中存在很多反向序列，因此RAPD擴增的是正向序列和反向序列之間的片段，引物在DNA模板上有很多結合位點，只有當2個引物結合位點較近且方向相反時，擴增才能進行。如果2個引物結合點彼此背離，擴增不會發生；引物結合點在相同的方向，擴增也不會發生；引物之間彼此相隔太遠（>2 000 bp），擴增也不會發生。引物結合位點DNA序列的改變可能導致引物無法與模板結合，從而擴增無法進行或擴增片段數目改變。2個擴增位點之間DNA堿基的缺失、插入等導致擴增片段數目和長度的差異。如圖3所示，用10 bp的隨機引物GCTGCTATCT進行擴增，個體c1將得到擴增長度約111 bp的片段，個體c2將得到擴增長度約74 bp的片段，個體c3由于發生點突變，引物無法與模板配對，因此擴增不出片段。RAPD 技術由于不涉及分子雜交和放射性自顯影技術，引物為完全隨機引物，因此設計引物時無須知道模板序列信息。RAPD 技術具有引物成本較低、DNA需要量少、技術簡便、操作方便、快速、引物通用等特點。但RAPD大多為顯性遺傳，不能鑒別顯性純合子和雜合子；RAPD技術的試驗重復性較差，結果可靠性較低。

2.2AFLP技術

擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）由Zabeau等在1995年創立，是基于PCR技術選擇性擴增基因組DNA限制性片段的技術[7]。AFLP技術先用限制性內切酶切割基因組DNA，一般采用雙酶切，雙酶切中一種為低頻剪切酶，另一種為高頻剪切酶，目前常用的是MseⅠ、EcoRⅠ和PstⅠ酶組合，其中EcoRⅠ為6個堿基識別位點的低頻剪切酶，MseⅠ為4個堿基識別位點的高頻剪切酶。雙酶切后得到大小不等的酶切DNA片段，產生的DNA片段長度一般小于500 bp，然后在其兩端接上雙鏈人工接頭，接頭由1個核心序列和1個酶切序列組成，一般為14～18 bp。如圖4所示，連上接頭的酶切片段就是DNA模板，引物由與人工接頭互補的5′端核心序列（GACTGCGTA）、對應于限制性酶切片段限制性末端的特異性酶切序列（CCAATT）及3′端選擇性堿基（CCACCT）三部分構成，引物的3′端選擇性堿基識別接頭序列和相鄰的限制性位點序列，擴增片段的特異性由選擇性堿基的種類、數目和順序決定，只有那些限制性位點側翼的核苷酸與引物的選擇性堿基相匹配的限制性片段才能被擴增出來。擴增產物可以用放射性同位素標記或聚丙烯酰胺凝膠電泳分離來檢測個體之間的差異。AFLP技術預先不需要知道被測基因組DNA信息，是在RAPD技術和RFLP技術基礎上發展起來的一種半隨機PCR技術，但是操作中通常要利用同位素標記，對樣品DNA質量要求高。

2.3SSR技術

SSR別微衛星DNA（micro satellite）、簡單序列重復多態性（simple sequence repeat polymorphisms，SSRP）或短串聯重復序列（short tandem repeat，STR）。簡單序列重復是一類由 2～6 bp 堿基組成的基序（核心序列）串聯重復而成的DNA序列，重復幾十次，基因位點長度一般在100～300 bp，其中最常見是2種堿基重復，如（AT）n、（AC）n等[8]。SSR在真核生物基因組中呈隨機分布，大約每隔10～50 kb就存在1個，但不同物種中的重復序列及重復單位頻率不同。同一物種內堿基種類不同的SSR，其豐度差別也很大。微衛星DNA兩端的序列一般都很保守，可以根據其兩端的保守序列設計1對特異引物，再利用PCR技術擴增每個位點的微衛星DNA序列，通過電泳分析核心序列的長度多態性[9]。SSR變異產生的原理如圖5所示，在個體d1中的基序為（GA）21，個體d2中為（GA）16，根據其兩端的保守序列設計的引物為5′-TGCCCTGTTATTTTCTTCTCTC-3′和3′-ACTTTACCCTTTCCTAGTGG-5′，其中個體d1預期擴增片段長度為184 bp，個體d2預期擴增片段長度為174 bp。

SSR具有呈共顯性遺傳的特點，可鑒別雜合子和純合子，并且SSR技術所需DNA量少。但是缺點是SSR具有相對的物種專一性，引物不能通用；以已知微衛星序列兩端的單拷貝序列來設計引物，需建立基因文庫、克隆識別與篩選、測序等過程；不同引物退火溫度不同，需要進行試驗探索。

3第3代DNA分子標記技術

3.1SNP標記技術

1996年，Vos等提出SNP技術，主要是指由基因組核苷酸水平上的單堿基的轉換、顛換變異引起的DNA序列多態性[10-11]。如圖6所示，對2個個體的部分核苷酸序列進行比較發現，其中個體e1中的堿基G顛換成個體e2中的堿基T，出現了1個SNP。SNP是許多物種基因組中最常見的變異形式，在基因組中的分布頻率很高，近年來，SNPs在人類[12-17]、老鼠[18]、擬南芥[19]、大麥[20-21]、大豆[22]、甜瓜[23]、玉米[24]和水稻[25-28]等多個物種中的高密度分布已有報道。作為第3代分子標記，SNP具有在基因組中數量多、分布密度高等特點，而且在基因分型過程中不需要根據片段大小將DNA分帶，可以大規模高度自動化地完成，比以SSR標記為代表的第2代分子標記密度高。SNP標記技術高效率的工作特點，更適于大量樣本的檢測分析。目前檢測SNP的最佳方法是 DNA芯片技術，SNP標記則被認為是很有應用前景的分子標記技術[29-30]。

SNP不是長度多態性，在設計引物時須將突變堿基落在突變引物的3′端，根據Taq酶缺乏3′→5′外切酶活性的特點，3′末端錯配堿基的引物，其延伸速度低于正常末端堿基配對的引物的延伸速度，因此特異性擴增條帶就不會出現，從而就表明模板DNA與引物3′末端沒有相應的突變；反之則表明模板DNA 上存在與引物3′末端相應的突變堿基。以圖6為例，個體e1的引物為5′-CACCGAAGATAGAAATGGAC-3′、

3′-CAGAGTAGAGGTAATTTTGT- 5′；個體e2的引物為5′-CACCGAAGATAGAAATGGAA 3′、3′- CAGAGTAGAGGTAATTTTGT - 5′。個體e1和個體e2的特異性引物只在3′端有1個堿基的差異，而它們的反向引物是相同的，反向引物的位置決定了擴增片段的長度，如圖6所示的擴增片段大小約為157 bp。為了增加擴增的特異性，可以在個體e1或個體e2的正向引物的3′端第3位上引入1個錯配，如5′- CACCGAAGATA GAA A TGAAC -3′[31]。由酶切序列的改變產生的分子標記如RFLP、CAPS等，由于涉及到分子雜交、放射性元素的利用及限制性內切酶消化不完全帶來的基因型判讀錯誤等問題，可把這類標記轉化成SNP標記得以實現。

3.2InDels標記技術

InDels（insert delete）標記即插入/缺失標記技術[32]，指幾個堿基的插入或缺失。很多研究人員把單堿基的插入/缺失也稱為SNP。如圖7所示，個體f1和個體f2的核苷酸序列出現了1個InDels標記，個體f1和個體f2之間只相差了2 bp，雖然從理論上講，聚丙烯酰胺凝膠可以區分1 bp的差異，但試驗條件要求很高才能區分2 bp的差異：凝膠要很薄，電泳時間也要比常規時間長。InDels標記為長度多態性，因此在此序列區域內設計InDels引物時，用長度多態性來區分這2個個體的效果往往不理想。

如果2個個體的核苷酸序列相比較，插入/缺失堿基數目較多，則可以用長度多態性區分。如圖8所示，個體g1與個體g2的核苷酸序列相比，不僅出現了3個SNPs，還有8 bp的InDels，這就使得在此堿基序列區域內開發的引物不僅容易區分2個個體，而且特異性更強[33]。

4分子標記技術的發展

分子標記作為一種高通量、能自動檢測基因組中核苷酸序列變化的標記方法，已經被廣泛應用于動植物的遺傳研究中，主要集中在基因定位[34-36]、輔助育種選擇[37-39]、功能基因鑒定[40-42]、遺傳多樣性分析[43-45]、疾病診斷與治療[46-48]等方面。各類分子標記的開發都是基于基因組核苷酸序列的差異，這種差異可能是內切酶識別序列的差異、編碼區的差異、非編碼區的差異、啟動子的差異、調控序列的差異等。這些差異可以是錯義突變、移碼突變，導致氨基酸變化引起表型變異，也可能是產生無義突變而導致多肽鏈的翻譯提前終止，從而產生無功能的蛋白質。另外，由于氨基酸密碼子的兼并性，這種差異可以導致沉默突變而不影響氨基酸的翻譯，在表型上沒有變化。因此，分子標記用在輔助育種進行選擇及作為疾病診斷的特異標記時，必須把基因型與表現型結合起來。隨著功能基因組時代的到來，開發并應用與功能基因緊密連鎖的分子標記，特別是利用基因本身序列開發的功能分子標記，已成為鑒定和選擇目的基因的有效途徑。理想的分子標記要具有多態性高、共顯性遺傳、開發成本和使用成本盡量低廉、檢測手段簡單快速、重復性好的特點。隨著分子生物學、基因組學等理論與技術的發展，必將研發出分析速度更快、成本更低、信息量更大的分子標記技術。

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