紅鳳菜總黃酮的富集方法

任冰如+陳劍+呂寒+等

摘要：探討從紅鳳菜新鮮莖葉中富集總黃酮的方法，以槲皮素為對照品，用比色法測定樣品中的總黃酮含量；以紅鳳菜新鮮莖葉為原料，比較用不同濃度乙醇提取總黃酮的效果；以乙醇粗提物為試驗樣品，比較不同吸附材料在靜態和動態情況下對總黃酮的吸附和解吸附性能。結果得到總黃酮含量的標準曲線為：y=2.215 7x-0.2511，r=0.999 1（n=3），其中x為吸光度，y為槲皮素的質量（mg）；結果還表明，用95%乙醇提取總黃酮的效果最佳，用大孔樹脂NKA分離總黃酮的效果最好，此外D-101、HPD-100、X-5也有較好的分離效果。綜合研究結果認為，用95%乙醇作提取溶劑、用NKA大孔樹脂吸附層析，可有效地富集紅鳳菜新鮮莖葉中的總黃酮。

關鍵詞：紅鳳菜；總黃酮；提??；分離

中圖分類號： R284.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0260-03

收稿日期：2013-09-23

項目來源：江蘇省產學研聯合創新資金（編號：BY2012213）；江蘇省科技基礎設施建設計劃-科技公共服務平臺項目（編號：BM2011117）。

作者簡介：任冰如（1964—），女，江蘇宜興人，博士，研究員，主要從事植物資源的研究與開發工作。Tel：（025）84347081；E-mail：renbingru@263.net。

通信作者：李維林，博士，研究員，研究方向為植物學。E-mail：lwlcnbg@mail.cnbg.net。紅鳳菜（Gynura bicolor）為菊科菊三七屬植物，別稱血皮菜、觀音菜、觀音莧、紫背天葵等，可以作為蔬菜食用，近年來在江蘇等多個地區都有栽培和銷售。紅鳳菜全草可入藥，味甘、辛，性涼，具有涼血止血、清熱消腫的功效[1]。有研究顯示，紅鳳菜含有黃酮類物質[2-4]，黃酮類物質具有保護心血管、抗腫瘤、抗糖尿病、抗氧化、抗炎、抗病毒等活性[5]，因此從紅鳳菜中提取黃酮類物質具有重要意義。本試驗以紅鳳菜的新鮮莖葉為原料，探討用不同濃度乙醇提取總黃酮的效果，并在此基礎上選用不同吸附材料對紅鳳菜粗提物中的總黃酮進行吸附與解吸附試驗，以期篩選分離效果優良的吸附材料，有效地富集總黃酮。

1材料與方法

1.1試驗儀器

Mettler AE-240十萬分之一電子天平；KQ-300DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；BM252C電動攪拌機，廣東美的精品電器制造有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；HY-4A數顯調速多用振蕩器，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.2試驗材料

紅鳳菜于2003年7月引自中國重慶，憑證標本號0648614，憑證標本保存于江蘇省中國科學院植物研究所標本館（NAS）。紅鳳菜的新鮮莖葉采自江蘇省中國科學院植物研究所的試驗苗圃中。

NKA大孔樹脂，購自南開大學化工廠；AB-8大孔樹脂，購自天津南開和成科技有限公司；HPD-100、X-5大孔樹脂，購自河北滄州寶恩化工有限公司；D101大孔樹脂，購自天津海光化工有限公司；100-200目聚酰胺粉末，購自浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠。

1.3試驗試劑

槲皮素對照品購自中國食品藥品檢定研究院，批號：100081-200907，ID：A34P-2DV6。所用試劑均為分析純。

1.4試驗方法

1.4.1總黃酮含量的標準曲線制作及樣品總黃酮含量的測定精確稱取12.1 mg槲皮素對照品，用80%乙醇定容至 50 mL，即配成濃度為0.242 g/L的溶液。分別精確吸取0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL槲皮素對照品溶液至7支試管中，每個濃度重復3次；分別加入0.3 mL 5% NaNO2，搖勻；6 min后分別加入0.3 mL 10% Al（NO3）3，搖勻后放置6 min；加入4.0 mL 4% NaOH并加水定容至10 mL，放置10～15 min；在510 nm處測定吸光度值（D510 nm）。以加入的槲皮素含量（mg）為縱坐標，測得的D510 nm為橫坐標，計算線性相關方程，作為測定總黃酮含量的標準曲線。吸取一定體積的待測樣品代替槲皮素對照品，以相同的方法測定D510 nm，根據標準曲線計算樣品中的總黃酮含量。

1.4.2不同濃度乙醇提取紅鳳菜總黃酮的試驗稱取4份20 g紅鳳菜鮮葉，分別加入100 mL體積分數為0、50%、70%、95%的乙醇水溶液，電動攪拌機勻漿后用超聲波提取1 h（設定溫度為50 ℃，功率為90%），過濾后精確吸取3 mL濾液，按“1.4.1”中的方法測定總黃酮含量，每個樣品重復2次。分別取3 mL不同濃度的乙醇提取液并用70%乙醇定容到10 mL，作為不同提取液的空白對照。

1.4.3不同層析材料對紅鳳菜總黃酮的吸附分離特性試驗

1.4.3.1紅鳳菜總黃酮提取液的制備稱取1 000 g新鮮紅鳳菜莖葉，加入4 000 mL 95%乙醇，超聲波提取后過濾，將濾渣重復提取1次，合并濾液并濃縮至500 mL，置于冰箱中沉淀去雜；過濾后取濾液，減壓濃縮以去除殘余乙醇，定容至250 mL，得紅鳳菜總黃酮粗提液。

1.4.3.2不同層析材料的靜態吸附篩選試驗分別稱取 1.00 g 處理過的NKA大孔樹脂、HPD-100大孔樹脂、D101大孔樹脂、X-5大孔樹脂、AB-8大孔樹脂和100～200目聚酰胺粉末，裝入三角瓶中后分別加入20.0 mL紅鳳菜總黃酮粗提液，振蕩4 h以使總黃酮充分被吸附，過濾即得20.0 mL吸附液。取上述飽和吸附后的層析材料，分別加入15.0 mL 80%乙醇，振蕩4 h使總黃酮充分解吸附，過濾即得 15.0 mL 解吸附液。吸取0.1 mL各吸附液、解吸附液，按“1.4.1”中的方法測定總黃酮含量，按照下列公式計算不同層析材料在室溫下的吸附量、吸附率、解吸附量及解吸附率。endprint

吸附量（mg/g）=（原液總黃酮含量×原液體積-吸附液總黃酮含量×吸附液體積）/樹脂質量；

吸附率=[（原液總黃酮含量-吸附液總黃酮含量）/原液總黃酮含量]× 100%；

解吸附量（mg/g）=（解吸液總黃酮含量×解吸液體積）/樹脂質量；

解吸率= 解吸附量/吸附量×100%。

1.4.3.3不同層析材料的動態吸附篩選試驗分別稱取 3.00 g 處理過的NKA大孔樹脂、HPD-100大孔樹脂、D101大孔樹脂、X-5大孔樹脂、AB-8大孔樹脂和100～200目聚酰胺粉末，按濕法裝柱，得床體積5 mL；用10倍床體積的純凈水洗滌，吸取10.0 mL紅鳳菜總黃酮提取液上柱，收集流出液，得10.0 mL過柱流出液；各柱加水10 mL洗脫，收集流出液，得10 mL水洗脫液；再加入15 mL 80%乙醇洗脫并收集流出液，得15 mL解吸附液。用上述方法測定各溶液中的總黃酮含量。按以下公式計算不同層析材料的上柱量、吸附量、解吸附量和解吸附率。

上柱量（mg/g）=（原液總黃酮含量×原液體積-過柱流出液總黃酮含量×過柱流出液體積）/樹脂質量；

吸附量（mg/g）=（原液總黃酮含量×原液體積-過柱流出液總黃酮含量×過柱流出液體積-水洗脫液總黃酮含量×水洗脫液體積）/樹脂質量；

解吸附量（mg/g）=（解吸液總黃酮含量×解吸液體積）/樹脂質量；

解吸附率=解吸附量/吸附量×100%。

2結果與分析

2.1總黃酮含量的標準曲線

以槲皮素為對照品，用比色法測得的總黃酮含量的標準曲線，其中x為吸光值，y為槲皮素的質量（mg），回歸方程為：y=2.215 7x-0.251 1，r=0.999 1（n=3）?？梢钥闯鲩纹に卦?.242 ～0.968 mg范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

2.2不同濃度乙醇提取紅鳳菜總黃酮的試驗

水提液中的總黃酮含量最低，隨著乙醇濃度的增加，提取液中的總黃酮含量明顯增加，以95%乙醇的提取效果最好。

不同乙醇濃度對紅鳳菜新鮮莖葉中總黃酮的提取效果

樣品編號乙醇濃度

（%）提取液的總黃酮含量（mg/mL）重復1重復2平均值100.0040.0050.0052500.2080.2260.2173700.8340.7580.7964950.8850.9110.898

2.3不同層析材料對紅鳳菜總黃酮的吸附分離特性試驗

2.3.1不同層析材料的靜態吸附篩選試驗各種層析材料對紅鳳菜總黃酮的靜態吸附效果。

不同層析材料的對紅鳳菜總黃酮的靜態吸附效果

層析材料類型結構

特性吸附量

（mg/g）吸附率

（%）解吸附量

（mg/g）解吸附率

（%）NKA大孔樹脂非極性12040.96150.6HPD-100大孔樹脂非極性14549.57652.1D-101大孔樹脂非極性15051.17751.5X-5大孔樹脂非極性12542.77056.2AB-8大孔樹脂弱極性12943.96550.8聚酰胺極性12743.46147.9

可以看出，5種大孔樹脂對紅鳳菜粗提物中總黃酮的靜態吸附效果有差異，其中D-101、HPD-100大孔樹脂的吸附量、吸附率、解吸附量均較高，解吸附率與AB-8、NKA大孔樹脂相近但低于X-5大孔樹脂。

極性吸附材料聚酰胺的吸附量、吸附率和解吸附量均低于D-101、HPD-100大孔樹脂，與NKA、X-5、AB-8大孔樹脂相當，解吸附率則低于所有選用的大孔樹脂。

因此可見，在所測定的6種層析材料中，D-101、HPD-100大孔樹脂有較好的靜態吸附性能，但解吸附率并不突出；X-5大孔樹脂的靜態吸附效果一般，但解吸附率最高；聚酰胺的靜態吸附性能一般，解吸附性能最低。

2.3.2不同層析材料的動態吸附篩選試驗表3是各種層析材料對紅鳳菜總黃酮的動態吸附效果，可以看出其吸附情況與靜態吸附有較大差異。

不同層析材料的對紅鳳菜總黃酮的動態吸附效果

層析材料類型結構特性上柱量

（mg/g）吸附量

（mg/g）解吸附量

（mg/g）解吸附率

（%）NKA大孔樹脂非極性33272280.5D-101大孔樹脂非極性31252081.2HPD-100大孔樹脂非極性31252184.3X-5大孔樹脂非極性30241979.4AB-8大孔樹脂弱極性27211675.0聚酰胺極性3322943.4

由結果可以看出，與5種大孔樹脂相比，極性較高的吸附材料聚酰胺的上柱量較高，達33 mg/g；但吸附量低于NKA、HPD-100、D-101和 X-5大孔樹脂，略高于AB-8大孔樹脂；而其解吸附量與解吸附率則大大低于所選用的5種大孔吸附樹脂?？梢妼τ诩t鳳菜總黃酮來說，聚酰胺的吸附性能尚可，但解吸附能力較差，不宜用于紅鳳菜粗提物中總黃酮的分離。

還可以看出，在所選用的5種大孔吸附樹脂中，弱極性的AB-8大孔樹脂對紅鳳菜粗提物中總黃酮的上柱量、吸附量、解吸附量和解吸附率均低于其他4種非極性大孔樹脂；而非極性的NKA大孔樹脂的上柱量、吸附量、解吸附量均最高，解吸附率低于HPD-100大孔樹脂，與D-101、X-5大孔樹脂相當。

綜合考慮以上動態吸附的指標，NKA大孔樹脂是分離紅鳳菜粗提物中總黃酮的優選吸附材料，其他3種非極性大孔樹脂即D-101、HPD-100、X-5大孔樹脂也有較好的分離效果。

3討論

研究結果顯示，紅鳳菜中的黃酮類化合物主要是槲皮素、山柰酚及其苷類物質[2-4]，因此可以采用乙醇-水混合溶劑進行提取。裴詠萍等以干燥的紅鳳菜葉片為原料，研究了紅鳳菜總黃酮的提取工藝，結果表明乙醇濃度對總黃酮的提取有顯著影響，以70%乙醇提取效果最好[6]。由于紅鳳菜新鮮莖葉含水量高于90%[7]并且莖稈呈肉質狀而難以干燥，為了節省勞力、降低能耗，本試驗直接采用新鮮莖葉為原料進行提取。通過比較不同濃度乙醇的提取效果顯示，95%乙醇對紅鳳菜新鮮莖葉的總黃酮提取效果最佳。endprint

一般認為，大孔吸附樹脂的吸附是依靠樹脂與化合物之間的范德華引力或形成的氫鍵，聚酰胺的吸附作用是依靠其分子中的酰胺羰基與黃酮類化合物的酚羥基形成的氫鍵[5]，大孔樹脂和聚酰胺均被廣泛應用于黃酮類化合物的分離和富集。本次試驗結果顯示，被極性吸附材料聚酰胺所吸附的總黃酮的解吸附性遠遠低于非極性或弱極性的大孔樹脂，其原因可能是聚酰胺與黃酮分子間形成了較穩定的氫鍵，導致難以解吸附。

雖然在靜態吸附試驗中大孔樹脂D-101、HPD-100表現出了較好的吸附性能，但在動態吸附試驗中其吸附性能均低于NKA，說明大孔樹脂D-101、HPD-100吸附的總黃酮容易被水洗脫，而NKA能較牢固地吸附總黃酮。在動態吸附試驗中，NKA大孔樹脂既有較好的吸附性能又有較好的解吸附性能。為了有效地分離紅鳳菜粗提物中的總黃酮，并綜合考慮各種材料的吸附效果，應優先選用NKA大孔樹脂進行動態柱層析；同時試驗表明，非極性的D-101、HPD-100、X-5大孔樹脂也有較好的分離效果。

參考文獻：

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[5]吳立軍. 天然藥物化學[M]. 4版.北京：人民衛生出版社，2003：173-216.

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[7]汪泓江，梁呈元，卓敏，等. Gynura屬3個野生蔬菜營養成分的比較及評價[J]. 中國野生植物資源，2004，23（5）：48-49.魏丕偉，熊俐，王凌云，等. 超聲-微波輔助提取枳椇多糖的研究[J]. 江蘇農業科學，2014，42（6）：263-266.endprint

一般認為，大孔吸附樹脂的吸附是依靠樹脂與化合物之間的范德華引力或形成的氫鍵，聚酰胺的吸附作用是依靠其分子中的酰胺羰基與黃酮類化合物的酚羥基形成的氫鍵[5]，大孔樹脂和聚酰胺均被廣泛應用于黃酮類化合物的分離和富集。本次試驗結果顯示，被極性吸附材料聚酰胺所吸附的總黃酮的解吸附性遠遠低于非極性或弱極性的大孔樹脂，其原因可能是聚酰胺與黃酮分子間形成了較穩定的氫鍵，導致難以解吸附。

雖然在靜態吸附試驗中大孔樹脂D-101、HPD-100表現出了較好的吸附性能，但在動態吸附試驗中其吸附性能均低于NKA，說明大孔樹脂D-101、HPD-100吸附的總黃酮容易被水洗脫，而NKA能較牢固地吸附總黃酮。在動態吸附試驗中，NKA大孔樹脂既有較好的吸附性能又有較好的解吸附性能。為了有效地分離紅鳳菜粗提物中的總黃酮，并綜合考慮各種材料的吸附效果，應優先選用NKA大孔樹脂進行動態柱層析；同時試驗表明，非極性的D-101、HPD-100、X-5大孔樹脂也有較好的分離效果。

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一般認為，大孔吸附樹脂的吸附是依靠樹脂與化合物之間的范德華引力或形成的氫鍵，聚酰胺的吸附作用是依靠其分子中的酰胺羰基與黃酮類化合物的酚羥基形成的氫鍵[5]，大孔樹脂和聚酰胺均被廣泛應用于黃酮類化合物的分離和富集。本次試驗結果顯示，被極性吸附材料聚酰胺所吸附的總黃酮的解吸附性遠遠低于非極性或弱極性的大孔樹脂，其原因可能是聚酰胺與黃酮分子間形成了較穩定的氫鍵，導致難以解吸附。

雖然在靜態吸附試驗中大孔樹脂D-101、HPD-100表現出了較好的吸附性能，但在動態吸附試驗中其吸附性能均低于NKA，說明大孔樹脂D-101、HPD-100吸附的總黃酮容易被水洗脫，而NKA能較牢固地吸附總黃酮。在動態吸附試驗中，NKA大孔樹脂既有較好的吸附性能又有較好的解吸附性能。為了有效地分離紅鳳菜粗提物中的總黃酮，并綜合考慮各種材料的吸附效果，應優先選用NKA大孔樹脂進行動態柱層析；同時試驗表明，非極性的D-101、HPD-100、X-5大孔樹脂也有較好的分離效果。

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