著色性干皮病基因D和p53對HBV復制的影響*

丁 浩， 張吉翔

(南昌大學第二附屬醫院消化內科，江西 南昌 330006)

著色性干皮病基因D(xeroderma pigmentosum D，XPD)是轉錄因子ⅡH(transcription factor ⅡH，TFⅡH)的其中一個組份[1]。已有研究發現，XPD可保護宿主細胞，阻止HIV和MMLV的感染，并下調已整合病毒的表達[2]。所以我們提出假設：XPD亦能抑制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)復制。本研究組已經證實，XPD能升高p53的表達[3-4]。因此，我們亦可提出假設：XPD可能通過p53通路抑制HBV復制。為證實上述假設，本研究把重組人XPD質粒用脂質體轉染進入人肝癌細胞株HepG2.2.15(整合并能復制HBV的HepG2細胞)，并使用pifithrin-α(p53抑制劑)孵育細胞，然后測定乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)、乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)和乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)的mRNA水平，檢測培養上清液中HBsAg、HBeAg和HBV-DNA含量，同時測定細胞內核心顆粒中HBV-DNA含量，探討XPD與p53對乙型肝炎病毒復制的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

肝癌細胞株HepG2.2.15是由復旦大學附屬華山醫院傳染科張軼俊博士惠贈；DMEM培養基購自HyClone；胎牛血清購自Gibco；G418購自Solarbio；重組質粒pEGFP-N2/XPD由本實驗室構建，pEGFP-N2/XPD已經通過PCR反應、酶切及基因測序鑒定[5]；RNA提取試劑Trizol和脂質體LipofectamineTM2000購自Invitrogen；p53抑制劑pifithrin-α購自Sigma；逆轉錄試劑盒購自Fermentas；引物購自Generay Biotech；2×Taq PCR Master Mix購自天根生物；HBsAg和HBeAg的ELISA檢測試劑盒購自廣東中山生物工程有限公司； VERSANT HBV branched DNA (bDNA) 檢測試劑盒購自Bayer；HBV-DNA熒光定量PCR試劑盒購自廣州中山大學達安基因公司。

2 方法

2.1細胞培養、質粒轉染和pifithrin-α的孵育 把HepG2.2.15細胞放置于含有10%胎牛血清、400 mg/L G418和雙抗(100 mg/L鏈霉素和1×105U/L青霉素)的DMEM培養瓶中，在37 ℃、5% CO2和飽和濕度的培養箱中培養。以每孔1×105細胞的密度把細胞鋪于6孔板中，24 h后細胞融合率為90%。使用LipofectamineTM2000將空載質粒pEGFP-N2和重組質粒pEGFP-N2/XPD轉染進入細胞，質粒4.0 μg/well，脂質體10 μL/well介導轉染。轉染后的第2天使用20 μmol/L pifithrin-α孵育細胞24 h。將實驗分為5組：(1)空白對照組；(2) pEGFP-N2組；(3) pEGFP-N2/XPD組；(4)pEGFP-N2/XPD+ pifithrin-α組；(5)pifithrin-α組。

2.2RT-PCR RNA抽提和逆轉錄參照試劑盒說明書進行。XPD上游引物5’-TCTGCCTCTGCCCTATGAT-3’，下游引物5’-CGATTCCCTCGGACACTTT-3’，產物大小為363 bp；HBsAg上游引物5’-AACATCAACTACCAGCACG-3’，下游引物5’-CACTGAACAAATGGCACTA-3’，產物大小為210 bp；HBeAg上游引物5’-CCTGCTCAAGGCAACTCT-3’，下游引物5’-GAAAGCCCTACGAACCAC-3’, 產物大小為182 bp；HBx上游引物5’-CACTTCGCCTCACCTCTG-3’，下游引物5’-TCGGTCGTTGACATTGCT-3’, 產物大小為112 bp；β-actin上游引物5’-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，下游引物5’-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3’，產物大小為434 bp。PCR反應體系配制如下：上、下游引物各1 μL，cDNA 500 ng，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，補ddH2O至25 μL終體積。以下列條件進行PCR 反應：預變性，1個循環， 94 ℃ 5 min；PCR反應，35個循環，94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 55 s；延伸，72 ℃ 7 min。取5 μL PCR反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳，使用紫外透射儀觀察電泳結果并拍照。拍照結果用BANDLEAD 3.00軟件進行分析，以目的條帶/β-actin的吸光度比值進行對比。

2.3ELISA配洗滌液，將濃縮洗滌液用蒸餾水或ddH2O以1∶25的比例稀釋。將待測樣品以50μL/well加入包被板，并設陰性對照、陽性對照和空白對照各2孔(陰性、陽性對照孔分別加入相應對照血清各50μL，空白對照孔則加入100μL洗滌液)。立即加入酶標記物50μL/well(空白對照孔則不加)，混勻。覆蓋封板膠，放置于37 ℃避光孵育30min。使用洗滌液洗板5次，每次均靜置1min，反扣晾干。加入底物A、B液各50μL/well，37 ℃避光顯色10min后，加入終止液50μL/well。使用酶標儀450nm(單波長)以空白對照孔調零，或者用450nm/630nm(雙波長)，檢測各孔吸光度(A)。

2.4HBV-DNA熒光定量PCR 取100 μL細胞培養上清液加入等量的DNA濃縮液，充分混勻、離心10 min。倒去上清，沉淀中加入30 μL DNA提取液，充分混勻、離心數秒，100 ℃水浴孵育10 min，離心后備用。按試劑盒說明書處理陰性質控品和陽性質控品。按比例(HBV PCR反應液40 μL/份+Taq酶3 μL/份)取相應量PCR反應液和Taq酶，充分混勻，按每管43 μL分裝至0.2 mL EP管中備用。向準備好試劑的0.2 mL EP管中分別加入處理后的樣品(包括標本、陰性質控品、臨界陽性質控品和強陽性質控品)上清液2 μL，離心，隨后放入樣品槽中。設置熒光定量PCR儀條件：93 ℃ 2 min;93 ℃ 45 s,55 ℃ 60 s,10個循環;93 ℃ 30 s,55 ℃ 45 s,30個循環。

2.5HBVbDNA實驗 將6孔板中的經實驗處理的細胞以PBS洗滌2次，用細胞裂解液將細胞轉移至EP管內，離心后保留上清液，加DNaseI和RNaseA37 ℃ 孵育15min后，以EDTA和PEG8000沉淀核心顆粒，然后重懸沉淀，加裂解液孵育過夜，用酚-氯仿-異戊醇抽提，干燥后溶于50μL雙蒸水中。應用bDNA試劑盒定量檢測HBV-DNA的滴度，其最低檢測值為0.7GEq/L。

3 統計學處理

實驗均重復6次，使用統計學軟件SPSS 13.0分析，數據用均數±標準差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 pEGFP-N2/XPD和pifithrin-α對HBsAg、HBeAg和HBx mRNA表達的影響

RT-PCR結果顯示，與空白對照組和轉染空載質粒pEGFP-N2組相比，轉染重組質粒pEGFP-N2/XPD組和pEGFP-N2/XPD+pifithrin-α組XPD mRNA的表達明顯增多(均P<0.01)；與空白對照組和轉染空載質粒pEGFP-N2組相比，轉染重組質粒pEGFP-N2/XPD組HBsAg、HBeAg和HBx mRNA的表達明顯減少(均P<0.01)；與空白對照組相比，pifithrin-α處理組HBsAg、HBeAg和HBx mRNA的表達明顯增多(P<0.05或P<0.01)；與轉染重組質粒pEGFP-N2/XPD組相比，pEGFP-N2/XPD+pifithrin-α組HBsAg、HBeAg和HBx mRNA的表達明顯增多(均P<0.01)；而空白對照組與轉染空載質粒pEGFP-N2組之間相比，差異無統計學意義(均P>0.05)，見圖1。

Figure 1. The changes of mRNA expression levels of XPD, HBsAg, HBeAg and HBx in HepG2.2.15 cells treated with pEGFP-N2/XPD and pifithrin-α.M: 100 bp marker; A: blank control group; B: pEGFP-N2 group; C: pEGFP-N2/XPD group; D: pEGFP-N2/XPD+pifithrin-α group; E: pifithrin-α group.Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs A or B; ##P<0.01 vs C;△P<0.01, △△P<0.05 vs A.

2 pEGFP-N2/XPD和pifithrin-α對細胞培養上清液中HBsAg和HBeAg含量的影響

ELISA結果發現，與空白對照組和轉染空載質粒pEGFP-N2組相比，轉染重組質粒pEGFP-N2/XPD組的培養上清液中HBsAg和HBeAg含量明顯減少(均P<0.01)；與轉染重組質粒pEGFP-N2/XPD組相比，pEGFP-N2/XPD + pifithrin-α組的培養上清液中HBsAg和HBeAg含量明顯增多(均P<0.01)；而空白對照組、轉染空載質粒pEGFP-N2組與pifithrin-α組三者之間相比，差異無統計學意義(均P>0.05),見圖2。

Figure 2. The content of HBsAg and HBeAg in the supernatants of culture medium of HepG2.2.15 cells treated with pEGFP-N2/XPD and pifithrin-α.A: blank control group; B: pEGFP-N2 group; C: pEGFP-N2/XPD group;D: pEGFP-N2/XPD + pifithrin-α group; E: pifithrin-α group.Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs A or B; ##P<0.01 vs C

3 pEGFP-N2/XPD和pifithrin-α對培養上清液和細胞內核心顆粒中HBV-DNA含量的影響

熒光定量PCR和bDNA結果顯示，與空白對照組和轉染空載質粒pEGFP-N2組相比，轉染重組質粒pEGFP-N2/XPD組的培養上清液和細胞內核心顆粒中HBV-DNA含量明顯減少(均P<0.01)；與轉染重組質粒pEGFP-N2/XPD組相比，pEGFP-N2/XPD + pifithrin-α組的培養上清液和細胞內核心顆粒中HBV-DNA含量明顯增多(均P<0.01)；而空白對照組、轉染空載質粒pEGFP-N2組與pifithrin-α組三者之間相比，差異無統計學意義(均P>0.05)，見圖3。

討 論

p53基因是公認的抑癌基因，當DNA受損時，p53先誘導細胞進入細胞周期的G1期，從而抑制細胞的增殖，直到受損DNA被修復。如果DNA不被修復，p53就介導受損細胞發生凋亡[6]。XPD是剪切修復基因，其蛋白有著重要的核酸剪切修復能力[7]。當DNA受損時，XPD能活化DNA的損傷檢控點，能修復受損DNA，增加基因穩定性，從而避免基因突變[8]。本研究組既往的實驗已經證實，XPD能上調肝癌細胞中p53的表達[3-4]。

Figure 3. The content of HBV-DNA in the supernatants of culture medium and the core particles in the HepG2.2.15 cells treated with pEGFP-N2/XPD and pifithrin-α.A: blank control group; B: pEGFP-N2 group; C: pEGFP-N2/XPD group; D: pEGFP-N2/XPD + pifithrin-α group; E: pifithrin-α group.Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs A or B; #P<0.01 vs C.

在我國范圍內，乙型肝炎是造成慢性肝炎、肝纖維化以及肝癌的主要原因[9]。HBV大量復制誘發了宿主肝細胞針對HBV的免疫應答，而后者導致了宿主肝細胞的損害，從而造成了肝炎和肝纖維化[10]。所以，抑制HBV復制以及徹底清除宿主肝細胞內的HBV是治療乙型肝炎的目標。但是，現在針對乙型肝炎的治療方法均不甚理想，效果有限。

Yoder等[2]的研究結果發現，XPD的核酸剪切修復功能的喪失能使得病毒MMLV在宿主細胞內的表達升高，即XPD能下調已整合的MMLV表達。所以，我們提出假設：XPD亦能抑制HBV在宿主細胞內復制。而且如前所述， XPD能升高p53表達[3-4]。因此，我們假設：XPD可能是通過p53通路來阻斷HBV復制。

為證實上述假設，本研究將重組質粒pEGFP-N2/XPD轉染進入肝癌細胞株HepG2.2.15，使得XPD表達增高，同時使用pifithrin-α抑制p53，然后檢測HBV復制的變化。需要指出的是，本研究使用的人肝癌細胞株HepG2.2.15是整合了HBV并能復制HBV的HepG2細胞株[11]。另外，本研究使用到的pifithrin-α是一種p53抑制劑，能可逆性阻斷p53依賴的基因轉錄激活[12-13]。

本研究發現，轉染重組質粒pEGFP-N2/XPD能下調HBsAg、HBeAg和HBx mRNA的表達，減少培養上清液中HBsAg、HBeAg和HBV-DNA含量，并減少細胞內核心顆粒中HBV-DNA含量。這表明，XPD可抑制HBV復制。本研究還發現，XPD上述作用均能被pifithrin-α阻斷。這表明，XPD阻斷HBV復制是通過p53通路而實現的。

本研究還發現，與空白對照組相比，pifithrin-α能上調HBsAg和HBeAg mRNA的表達，然而對培養上清液中的HBsAg、HBeAg和HBV-DNA的含量卻沒有明顯影響。就本研究結果來看，我們分析其可能原因是： pifithrin-α降低細胞內HBsAg和HbeAg mRNA的表達幅度原本較小，而HBsAg、HBeAg及HBV-DNA從細胞內釋放進入培養上清液后濃度即被稀釋，這導致了HBsAg、HBeAg及HBV-DNA在培養上清液中的含量被檢測時，與空白對照相比無明顯差異。

綜上所述，XPD可通過p53通路抑制HBV復制。所以，XPD和p53可能成為乙型肝炎抗病毒治療的分子作用靶點，為治療乙型肝炎提供新的可能途徑。

[參 考 文 獻]

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