骨髓間充質干細胞聯合維生素E對急性腎損傷炎癥反應的抑制作用*

趙 雷， 馮業童， 董 超， 周余來， 劉朋飛△

(1暨南大學第二臨床醫學院深圳市人民醫院麻醉科，廣東 深圳 518020； 2吉林大學藥學院再生醫學系，吉林 長春 130021)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是臨床常見腎臟疾病，該疾病發病率在普通人群中約為0.5%～1%，在住院患者中增長為2%～7%，而在ICU及術后患者中為4%～25%，在上述這些人群中，死亡率為28%～90%[1-2]。隨著醫療技術的發展，人類的許多疾病均得到了有效控制，但是至今尚未發展出對AKI的有效治療方法，該疾病相關的死亡率也沒有得到明顯改善，其發病率甚至有逐年增高的趨勢。近年來的研究表明，氧自由基損傷及并發的一系列炎癥反應可能與AKI有重要的聯系，因此，如何降低AKI中的氧自由基和某些炎癥介質造成的損傷成為了現階段人們的研究重點[3-5]。

骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)是骨髓中存在的一類成體干細胞，具有多向分化潛能，而且在體外增殖能力強，性能穩定，目前，研究人員已經證實BMSCs在腎衰竭治療方面有著重要的作用[6-8]；維生素E是一種脂溶性維生素，在眾多種類的維生素中，維生素E是最主要的抗氧化劑之一，因為氧自由基升高是導致腎細胞損傷的重要機制之一，所以，維生素E對急性腎衰竭也有一定的治療治療效果[9-10]。本課題組已經證實BMSCs聯合維生素E對AKI具有一定的治療作用，而且治療效果優于單一的治療模式，但是，相關治療機制尚不明確[11]。在本課題中，從炎癥蛋白抑制的角度進一步分析治療機制，評價治療效果，從而進一步促進這種聯合治療模式在臨床腎臟疾病治療方面的應用。

材 料 和 方 法

1 動物

清潔級Wistar大鼠，雄性，體重250～310 g，由吉林大學白求恩醫學院動物中心提供。動物許可證號為SCXK-(吉)2007-0003。

2 主要試劑和儀器

DMEM/F12培養基及胎牛血清購自Gibco；Percoll分離液購自Pharmacia；維生素E購自Sigma；Trizol RNA提取液購自Invitrogen；RNA反轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒均購自TaKaRa；所有引物序列均由上海生工生物工程有限公司合成；大鼠單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)、受激活調節正常T細胞表達和分泌因子(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor，RANTES)、白細胞介素-10(interleukin 10，IL-10)以及巨噬細胞炎癥蛋白-2(macrophage inflammatory protein 2，MIP-2)ELISA試劑盒均購自ASSAY；IX-70倒置相差顯微鏡及正置生物學顯微鏡均購自Olympus；EXL-808酶標檢測儀購自美國寶特公司；PCR儀購自北京東勝創新生物科技有限公司；real-time Quality PCR儀購自MJ Research。

3 方法

3.1大鼠BMSCs的分離培養 從雄性Wistar大鼠的股骨和脛骨中分離骨髓，并進一步用1 073 g/L的Percoll分離液分離骨髓中的BMSCs，用含10 %胎牛血清的DMEM/F12培養基懸浮細胞，于37 ℃、5 % CO2培養箱內培養。采用流式細胞術對BMSCs的特異蛋白的表達進行鑒定，同時，利用成骨分化培養基和成脂分化培養基誘導BMSCs定向分化，結果表明所獲得的BMSCs具有正常的間充質細胞表型，而且具有向成骨和成脂方向分化的潛能，具體鑒定結果可參考本課題組前期文章[11]。

3.2大鼠AKI動物模型的制備與治療 實驗動物共分6組，即空白對照組、造模組、造模+陽性藥物組、造模+維生素E組、造模+BMSCs組和造模+BMSC+維生素E組，每組6只大鼠。造模時大鼠每天給予腹腔注射慶大霉素140mg/kg，連續注射6d，造模結束后第1天開始進行治療。本研究的陽性藥物選用地塞米松，劑量為每天0.08mg/kg，維生素E劑量為每天80mg/kg，BMSCs劑量為每天每只大鼠1×106cells，均為尾靜脈注射，空白對照組和模型組給予等量溶劑，此階段各個實驗組均連續注射6d。

3.3炎癥蛋白mRNA表達水平檢測 治療結束后第1天，處死各組實驗動物，收集每組腎臟組織，各取40 mg的腎臟組織用1 mL Trizol 裂解液裂解，提取RNA后，通過反轉錄試劑盒進行反轉，并以反轉后的cDNA為底物，進行實時熒光定量PCR的操作，具體的反轉錄PCR和實時熒光定量PCR操作過程及反應程序均按試劑盒說明書進行，引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR實驗的引物

3.4炎癥介質的蛋白表達水平檢測 在治療結束后，收集各實驗組大鼠血液，離心后分離血漿成分，用于炎癥蛋白的分析。同時，收集各實驗組的腎臟組織，每組取0.2 g 腎臟組織用于組織研磨，離心后進一步收集組織研磨液，用于檢測炎癥蛋白。通過ELISA法從蛋白水平評價各實驗組血漿和腎臟組織中炎癥蛋白的表達量，具體的操作過程按ELISA試劑盒操作說明進行。

4 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，應用SPSS 17.0軟件分析，各組間均數比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 BMSCs的分離培養結果

采用密度梯度離心法分離的大鼠BMSCs，用含血清的DMEM/F12培養基進行培養，可以見到分離培養24 h后，細胞呈長梭形貼壁生長(圖1A)。隨著培養時間的延長，可以見到細胞的生長密度逐漸增大(圖1B)，一般4～6 d后，即可見到細胞的密集生長狀態(圖1C)。由此可見，本研究分離的大鼠BMSCs具有一定的體外增殖能力。

2 炎癥蛋白基因在腎臟組織中的表達結果

單一的維生素E不能顯著改變MCP-1和IL-10的表達，但是對于RANTES以及MIP-2的表達具有一定的抑制作用；另外，經過陽性藥物、BMSCs以及BMSCs聯合維生素E治療后，各種炎癥蛋白均有不同程度的下降，而且BMSCs聯合維生素E治療對RANTES以及MIP-2的抑制作用要明顯優于干細胞或維生素E單一治療組，見圖2。

Figure 1. The morphological characteristics of BMSCs. A: BMSCs cultured for 24 h; B: BMSCs cultured for 96 h; C: BMSCs cultured for 120 h. Scale bar = 200 μm.

Figure 2. The mRNA expression of inflammatory proteins in the kidney tissues.Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs model; #P<0.05 vs vitamin E or BMSCs.

3 各實驗組血漿中炎癥蛋白的含量變化

結果顯示，AKI大鼠血漿中的炎癥蛋白顯著增加；隨著治療的進行，除IL-10以外，各實驗組炎癥蛋白含量均有一定程度的下降，但是下降程度普遍較小，而且，維生素E組未見顯著療效；在MIP-2的調控方面，BMSCs聯合維生素E體現出最佳抑制效果，見圖3。

4 各實驗組腎臟中炎癥蛋白的含量變化

對腎臟組織中的炎癥蛋白相對含量的檢測結果可見，各實驗組的變化趨勢與實時定量PCR的檢測趨勢基本一致，但也略有不同。單一維生素E治療僅對MCP-1和MIP-2有一定的降低作用，而對于IL-10和RANTES沒有明顯作用。陽性藥物對于MIP-2的表達水平沒有明顯影響，這一結果與實時定量PCR中的結果一致。同時，BMSCs聯合維生素E進行治療對腎臟組織的RANTES以及MIP-2的調控存在抑制作用，也明顯優于干細胞或維生素E的單一治療，見圖4。

Figure 3. The protein levels of inflammatory proteins in the plasma of each group.Mean±SD.n=6. *P<0.05 vs model; #P<0.05 vs vitamin E or BMSCs.

Figure 4. The protein levels of inflammatory proteins in the kidney tissues.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs model; #P<0.05 vs vitamin E or BMSCs.

討 論

本課題從炎癥蛋白抑制的角度，進一步評價BMSCs聯合維生素E對AKI的治療效果，分別檢測了血漿和腎臟組織中的MCP-1、IL-10、RANTES和MIP-2的表達水平，其中MCP-1、RANTES和MIP-2均屬于正性炎癥蛋白分子，即增強炎細胞活性作用，而IL-10則屬于負性炎癥蛋白分子，即抑制炎細胞活性作用。隨著炎癥反應程度的增強，正性炎癥蛋白分子的表達量會逐漸升高，由于機體的代償作用，負性炎癥蛋白分子也會隨之上調。在經過一系列治療后，炎癥反應得到緩解，正性炎癥蛋白分子的表達量也會逐漸下降，同時，負性炎癥蛋白分子在達到一定程度后也會逐漸下降，恢復到正常水平。所以，正性炎癥蛋白分子與負性炎癥蛋白分子在本研究中體現了較為相似的變化趨勢。

在本課題中，選取地塞米松作為陽性藥物對急性腎損傷進行治療，而且取得了一定療效。作為一種糖皮質激素，地塞米松被廣泛用于腎損傷的臨床治療。在基礎醫學研究方面，地塞米松也可用于多種類型腎損傷(缺血再灌注損傷、環孢素A腎毒性損傷、硝酸雙氧鈾損傷和慶大霉素損傷等)的治療，而且均取得了一定療效[12]。所以，本課題選用地塞米松作為陽性藥物，雖然與造模組相比發揮了一定的治療效果，對某些炎癥蛋白分子有一定的調控作用，但地塞米松并非對所有的炎性蛋白都具有調節作用，本課題中，該藥物對腎臟組織中的MIP-2沒有明顯的調控作用，而對血漿中的MIP-2有一定的調節。

維生素E作為一種抗氧化劑，對氧自由基造成的損傷具有較強的保護作用，但是并不能直接起到抑制炎癥反應的作用，所以，本課題中的維生素E治療組在炎癥抑制方面并未表現出明顯的抑制作用，對很多炎癥蛋白的抑制強度與其它治療組相比，仍然具有較大的差距。BMSCs在腎損傷治療方面的作用也被多個課題組證實[6-8,13]，而且，間充質細胞本身就具有分泌多種調控蛋白，進而抑制炎癥反應的功能，所以，本課題中的BMSCs治療組也有較好的療效，而且，對某些炎癥蛋白分子的調控作用優于陽性藥物組。

目前，課題組已經證實：維生素E對BMSCs的增殖、分泌功能均無明顯的影響，二者聯合的優化作用可能是單獨作用結果的疊加，而非二者的協同作用[11]。同時，在炎癥抑制方面，維生素E只能通過抗氧自由基途徑緩解腎損傷癥狀，對炎癥反應無直接作用；而BMSCs則可以通過多種途徑參與腎臟損傷修復，并可直接抑制炎癥反應，緩解炎癥介質導致的腎損傷。由于作用途徑的不一致，BMSCs聯合維生素E的治療模式在某些炎癥介質的抑制方面，效果優于單一的干細胞或維生素E的治療模式，但是，尚無直接研究結果表明二者在炎癥抑制方面存在協同作用，本文中的聯合優化效果仍然可能是二者單獨作用的結果，對此，尚有待進一步的驗證和分析。

總的來講，本課題從抑制炎癥介質的角度，評價了BMSCs聯合維生素E對AKI的治療效果。結果表明，與單一的治療模式相比，BMSCs聯合維生素E對某些炎癥蛋白具有更強的抑制效果。但是，本課題中所用干細胞和維生素E的劑量還比較單一，最佳的作用劑量和作用模式以及深入的機制仍需進一步探索和研究。

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