糖尿病患者與健康人脂蛋白單糖組成差異研究*

郭守東， 馮 蕾， 張 穎， 崔英杰， 秦樹存

(泰山醫學院山東省高校動脈粥樣硬化重點實驗室， 山東 泰安 271000)

近年研究顯示，脂蛋白自身結構的改變是影響其功能的生物學機制之一，且脂蛋白自身結構改變而失去原有功能的現象在多種疾病中普遍存在[1-3]。脂蛋白糖基化修飾是最重要的蛋白質翻譯后修飾之一，其對于維持脂蛋白的功能至關重要。有研究證實，脂蛋白的唾液酸化修飾，主要是指N-乙酰神經氨酸(N-acetylneuraminic acid, NANA)化修飾，以及半乳糖、甘露糖等糖基構成對維持脂蛋白的正常生理功能十分重要；另有研究顯示，脂蛋白等的去唾液酸化與動脈粥樣硬化等心血管病變的發生和發展密切相關[4-6]。因此，脂蛋白單糖組成的精確測定是探究脂蛋白糖基化修飾與脂蛋白功能的重要技術手段之一。

測定單糖組成的方法主要包括高效液相色譜法、氣相色譜法和液相串聯質譜法等。由于糖類紫外吸收很弱，為提高檢測靈敏度，研究者常將糖復合物水解后采用柱前或柱后衍生化色譜法分離和檢測。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5- pyrazolone，PMP)柱前衍生化高效液相色譜法反應條件較溫和，產物無立體異構，紫外檢測靈敏度較高，可用于同時檢測中性、酸性及堿性單糖。本文建立一種高效液相色譜法測定脂蛋白上的中性和堿性單糖的PMP柱前衍生方法，結合串聯質譜法(liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)快速定量脂蛋白顆粒上的NANA，并對糖尿病患者和健康人脂蛋白顆粒的單糖構成進行比對分析。

材 料 和 方 法

1 材料和儀器

D(+)-葡萄糖(glucose，Glc)、D(+)-甘露糖(mannose, Man)、D(+)-半乳糖(galactose, Gal)、L(-)-巖藻糖(fucose, Fuc)、L(+)-阿拉伯糖(arabinose, Ara)、D(+)-葡萄糖胺(glucosamine, GlcN)、N-乙酰D(+)-葡萄糖胺(N-acetylglucosamine, GlcNAc)、L-鼠李糖(rhamnose, Rha)、D-葡萄糖醛酸(glycuronic acid, GlcUA)、D(+)-半乳糖醛酸(galactose-uronic acid, GalUA)、NANA、PMP、乙腈和溴化鈉購于Sigma；透析袋(MWCO 8000-14000)(北京Solarbio科技有限公司)；蛋白測定試劑盒購于Invitrogen；去離子水從Millipore 純水機獲取；其余試劑均為分析純。

Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(粒徑5 μm，4.6×250 mm)(Agilent)；2695型高效液相色譜儀(Waters)；Laboroto-4002型低壓旋轉蒸發儀(Heidolph)；TDL-5000B型低速冷凍離心機(中國上海嘉鵬科技有限公司)；3K30型高速冷凍離心機(Sigma)；Optima L-80XP型超速離心機(Beckman)；LC-MS/MS由島津 HPLC(LC-20AD、DGU-20A3脫氣機和SIL-20AC自動進樣器)、AB SCIEX的串聯質譜儀(4000 QTRAP)和PEAK牌氮氣發生器(ABN2ZA)組成。

2 方法

2.1脂蛋白分離 健康人(平均年齡52.5歲)及糖尿病患者(平均年齡51.8歲)血漿樣本采集于空腹12 h之后的早餐前，抗凝血液經1 000×g離心15 min獲得血漿，定量移入離心管，采用溴化鈉固體調節密度至1.006，充N2，封口，10 ℃下40 000 r/min離心24 h，取上層極低密度脂蛋白(very-low-density lipoprotein, VLDL)；下層采用溴化鈉固體調節密度至1.063，10 ℃下40 000 r/min離心48 h，獲得低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL)；余下液體采用溴化鈉固體調密度至1.21，10 ℃下40 000 r/min離心48 h，得高密度脂蛋白(high-density lipoprotein, HDL)。脂蛋白經透析，充N2，封口備用。

2.2單糖組成分析 分別精密稱取適量的Man、GlcN、Rha、GlcUA、GalUA、GlcNAc、Glc、Gal、Ara和Fuc等10種單糖標準品，加去離子水配制成100 mmol/L的單糖標準品儲備液。衍生過程及標準曲線制作等詳見參考文獻[7]。色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(粒徑5 μm，4.6×250 mm)；流動相：0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液/乙腈 (82∶18，V/V)；流速：1.0 mL/min；柱溫，30 ℃；紫外檢測波長：245 nm。脂蛋白經4 μmol/L三氟乙酸于120 ℃酸水解5 h，低壓旋轉蒸發去除三氟乙酸。所得單糖混合物采用PMP柱前衍生。將樣品色譜峰面積代入相應單糖的回歸方程即可得出各脂蛋白單糖構成的摩爾比例。

脂蛋白唾液酸的分析采用LC-MS/MS分析。取20 μg脂蛋白樣本加入pH=2的醋酸溶液200 μL，80 ℃下水解2 h，所得水解液加4倍甲醇沉淀蛋白，40 000×g離心20 min，0.22 μm濾膜過濾，濾出液進行LC-MS/MS分析[8-9]。色譜柱為Waters C18分析柱(Waters Symmetry?, 外徑3.5 μm, 內徑2.1 mm×100 mm)；流動相為含有4 mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸的5%的甲醇溶液；加樣體積為5.0 μL，流動相流速為0.4 mL/min；質譜采用電噴霧離子源的多反應監測(multiple reaction monitoring, MRM)模式進行，監測離子對的m/z為308.1/86.7；溫度500 ℃，霧化氣、輔助氣和氣簾氣分別設定為55、55和20 psi，其中碰撞氣為中等(medium)，在負離子模式下的噴霧電壓(ion-spray voltage)為-4 500V，碰撞能量為-16 eV，去簇電壓為-60 V。數據分析采用AB SCIEX 1.6分析軟件。

3 統計學分析

采用SPSS 17.0進行統計學分析。數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

完全酸水解樣品經PMP衍生后，經Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱分離衍生產物，采用紫外檢測器進行檢測。圖1A為10種單糖標準品經PMP柱前衍生后所得液相色譜圖，圖中的標注以單糖名稱代指其衍生產物。實驗中衍生引入雜質的保留時間小于16 min，而單糖衍生物的保留時間在20 min以上，實現了衍生過程中引入的雜質與樣品衍生產物之間的有效分離，即該法可有效分離哺乳動物常見的中性、酸性和堿性單糖。健康人HDL(H-HDL)和糖尿病患者HDL(D-HDL)單糖組成如圖1B和C所示，可見HDL糖鏈由Man、GlcN、GlcNAc、Glc和Gal構成。如表1所示，采用LC-MS/MS法測定的H-HDL和D-HDL中NANA的含量分別為(2.14±0.12)和(3.53±0.27) mmol/(g protein)。如表1和圖1所示，H-HDL中Man、GlcN、GlcNAc、Glc和Gal的含量依次為：(5.88±0.94)、(16.49±4.11)、(1.31±0.33)、(0.87±0.16)、(7.18±1.64) mmol/(g protein)；D-HDL中Man、GlcN、GlcNAc、Glc和Gal的含量依次為：(8.68±0.39)、(24.73±5.50)、(1.91±0.54)、(1.23±0.35)和(9.73±2.85) mmol/(g protein)。可知，D-HDL中Glc和Gal的含量顯著升高(P<0.05)，且Man、GlcN和NANA的含量較H-HDL上升更顯著(P<0.01)。

LDL的單糖組成與HDL相同，如表1和圖2所示。采用LC-MS/MS法測定的H-HDL和D-HDL中NANA的含量分別為(6.86±0.11)和(6.45±0.18) mmol/(g protein)。H-LDL中Man、GlcN、GlcNAc、Glc和Gal的含量依次為：(29.20±3.57)、(50.77±4.72)、(5.28±0.64)、(10.06±1.37)和(28.44±3.96) mmol/(g protein)；D-LDL中Man、GlcN、GlcNAc、Glc和Gal的含量依次為：(30.08±3.78)、(38.52±6.38)、(3.79±0.78)、(7.63±1.50)和(20.05±2.63) mmol/(g protein)。經比對分析，可知D-LDL較H-LDL中GlcN和Gal含量顯著下降(P<0.05)，同時GlcNAc、Glc和NANA含量均有所下降，但無顯著差異。

VLDL由Man、GlcN、Glc、Gal和NANA構成，如表1和圖3所示。采用LC-MS/MS法測定的H-VLDL和D-VLDL中NANA的含量分別為(2.95±0.24)和(4.42±0.15) mmol/(g protein)。H-VLDL中Man、GlcN、Glc和Gal的含量依次為：(91.21±4.12)、(27.05±2.34)、(4 230.95±15.83)、(43.40±3.75) mmol/(g protein)；D-VLDL中Man、GlcN、Glc和Gal的含量依次為：(82.40±0.51)、(30.16±0.32)、(4 722.73±93.27)、(34.05±2.81) mmol/(g protein)。可知D-VLDL較H-VLDL中的NANA含量顯著上升(P<0.01)，而Gal的含量也顯著升高(P<0.05)。此外，VLDL的單糖組成色譜圖中存在一無法歸屬的色譜峰。

表1 健康人和糖尿病患者血漿脂蛋白單糖組成

*P<0.05,**P<0.01vsH-group.

Figure 1. Typical chromatograms of 10 kinds of monosaccharide standards and the HDL samples after complete acid hydrolysis. A: typical chromatogram of 10 kinds of monosaccharide standards after PMP derivatization; B: monosaccharide composition of the HDL from healthy participants after acid hydrolysis; C: monosaccharide composition of the HDL from diabetic patients after acid hydrolysis.

討 論

由于糖基之間連接位點的復雜性，糖結構的研究一直是生物化學研究中的重點和難點。隨著質譜的發展，LC-MS/MS已成功應用于多種疾病相關分子的檢測，為探討疾病發生發展的分子機制提供了必不可少的技術手段[10]。本文采用PMP柱前衍生法建立了測定脂蛋白樣本單糖組成的方法，該法可將脂蛋白上的中性和堿性單糖完全分離，實現定量分析；同時結合液相串聯質譜法檢測脂蛋白上的唾液酸含量。本研究結果顯示，糖尿病患者脂蛋白上糖基化修飾與健康人相比發生了顯著改變，而每種脂蛋白單糖組成的改變情況不同。如表1所示，糖尿病患者HDL的糖基化修飾程度較同齡健康人HDL升高達35.52%；糖尿病患者LDL的GlcN和Gal的糖基化修飾程度下降24.13%；糖尿病患者VLDL的Gal糖基化修飾下降達21.54%，但NANA含量升高達49.83%。本團隊正在借助陰離子交換柱層析、凝膠柱層析和高分辨串聯質譜等技術手段開展糖尿病患者與健康人脂蛋白糖基化差異的精細研究。

Figure 2. Typical chromatograms of the LDL samples after complete acid hydrolysis and PMP derivatization. A: monosaccharide composition of the LDL from healthy participants after acid hydrolysis; B: monosaccharide composition of the LDL from diabetic patients after acid hydrolysis.

已有研究表明，脂蛋白上大約50%的負電荷是由唾液酸提供的。糖尿病患者HDL和VLDL唾液酸含量較之健康人顯著升高(P<0.01)，而糖尿病患者LDL唾液酸含量卻有所下降。脂蛋白，特別是HDL糖基化修飾改變勢必影響HDL的抗氧化、抗炎癥[11]和膽固醇逆向轉運等功能。我們尚未發表的數據顯示，NANA具有抗氧化功能，在清除DPPH自由基、·OH自由基和對抗H2O2等方面具有較好的生物活性，上述研究結果與先前報道一致[12-14]。氧化應激伴隨著糖尿病的發生發展[15]，因此，氧化應激可能對脂蛋白的糖基化產生重要影響。已有研究表明，在心血管疾病狀態下，肝臟會產生大量唾液酸化的糖蛋白，且伴隨唾液酸轉移酶活性的顯著升高。據此，可以假設在氧化應激狀態下，機體為了保護脂蛋白等顆粒或細胞的正常功能，產生富唾液酸化的糖蛋白，一方面增強自身抗氧化功能，另一方面唾液酸提供的負電荷可有效保護血管內脂蛋白之間以及脂蛋白與內皮細胞之間的黏附和蓄積。另有研究顯示，LDL的去唾液酸化或經甘露糖苷酶水解處理后，可讓LDL中的膽固醇蓄積[16-18]。結合文獻報道及本研究的實驗結果，可以推測糖尿病患者較同齡健康人LDL的去唾液酸化可能是糖尿病患者易發動脈粥樣硬化等心血管疾病的誘發因素之一。

Figure 3. Typical chromatograms of the VLDL samples after complete acid hydrolysis and PMP derivatization. A: monosaccharide composition of the VLDL from diabetic patients after acid hydrolysis; B: monosaccharide composition of the VLDL from healthy participants after acid hydrolysis.

[參 考 文 獻]

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