比格犬雌激素受體β四個剪接異構體的發(fā)現(xiàn)

許 琴，董 翔，李建瑛，許永華，任秀梅，趙彥斌，白杰英，孫兆增，曾 林，胡仲明

(1. 軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，北京 100071； 2. 蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院動物實驗科，烏魯木齊 830000)

作為標準實驗動物，比格犬在醫(yī)藥、公共衛(wèi)生、生命科學以及軍事醫(yī)學研究領域得到了廣泛的應用。但隨著實驗動物化時間的延長以及長期的封閉群繁殖飼養(yǎng)，我國比格犬種群中出現(xiàn)了不同程度的繁殖障礙。為解決上述生產(chǎn)中遇到的問題，對比格犬生殖生理進行研究很有必要。雌激素通過其受體在下丘腦-垂體-卵巢軸對雌性動物的生殖機能進行著周期性的調(diào)控。雌激素受體有三種亞型α、β、γ(Estrogen receptor α, β, γ， ERα， ERβ， ERγ)，其中ERγ僅存在于魚類[1]。有研究表明在不同生殖周期中，ERα、ERβ的表達水平，表達時間及組織表達部位不同[2]，并且ERα敲除小鼠雌性不育，雄性繁殖力嚴重下降，ERβ敲除小鼠雌性與雄性能夠繁殖，但產(chǎn)仔率降低，窩產(chǎn)仔數(shù)明顯減少，并且已有研究表明ERβ是一種雌激素依賴性腫瘤的抑制因子[3-5]，為了解ERβ在比格犬下丘腦-垂體-性腺軸發(fā)揮的調(diào)控作用，研究團隊自2011年以來，對比格犬生殖內(nèi)分泌軸上ERβ的剪接異構體存在情況進行了篩查[6-7]，發(fā)現(xiàn)了ERβ的四個剪接異構體，現(xiàn)總結報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要儀器

PCR擴增儀(PTC-2000，BIO-RAD)，高速冷凍離心機(3-18K，SIGMA)，-80℃超低溫冰箱(NU-9483E，NUAIRE)，微量分光光度計(NanaDrop 2000，Thermo)，核酸電泳儀(ESP1001， amersham pharmacia biotech)，紫外凝膠成像儀(ACI，UVP)，180℃干烤手術器械一套，移液器一套(Eppendof)。

1.1.2 主要試劑

Trizol購自 Invitrogen 公司，DEPC購自 Promega 公司，ReverTra-Ace反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TOYOBO公司，pMD18-T Vector, LA Taq酶，dNTPmix，2×GC buffer購自大連寶生物公司TaKaRa產(chǎn)品，標準分子量核酸DNA Marker DL-2000 購自康為世紀公司，DNA片段凝膠回收試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒為博邁德公司BioFlux產(chǎn)品，其它試劑均由軍事醫(yī)學科學院條件處提供，為進口分裝或國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 菌種及實驗動物

大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自博邁德生物公司。

雌性比格犬11只(9只間情期犬，編號為1-9號；2只發(fā)情期犬，編號為F1，F(xiàn)2)，18～20 kg，由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供【SCXK (軍) 2012-001】，取材在軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心實驗室內(nèi)進行【SYXK(軍)2012-005】。

1.2 實驗方法

1.2.1 組織標本的獲取

取材器械包高壓滅菌后，180℃干烤8 h以上備用，組織凍存管0.1% DEPC水處理后高壓滅菌備用。實驗動物用速眠新Ⅱ注射液(1.5 mL/支)，按照0.08～0.1 mL /kg體重肌肉注射，待動物麻醉癱軟后，頸動脈放血處死動物，迅速留取下丘腦、垂體、子宮、卵巢組織標本，于凍存管中液氮凍存。

1.2.2 引物設計

根據(jù)NCBI網(wǎng)站公布的比格犬雌激素受體-β mRNA CDS區(qū)序列(犬ESR2 mRNA 24轉(zhuǎn)錄本，gene 1968 bp，CDS區(qū)1593 bp，Gene ID:403639)設計兩對引物：真核ERβ-F：CCCAAGCTTATGGATATCAA AAACTCTCCATCTAGCC；真核ERβ-R：CGCGGA TCCTCACTGAGATGTGGTCTTCTGGGAGC，用于擴增全長序列。經(jīng)限制性內(nèi)切酶分析后，在犬ERβ一對引物的上游引入Hind Ⅲ，下游引入BamH Ⅰ內(nèi)切酶位點，為構建真核表達重組子，在引物的下游均去除了終止密碼子TGA。

篩查比格犬ERβ可能存在的兩兩外顯子缺失的剪接異構體，設計引物如下：

1.2.3 下丘腦、垂體、卵巢、子宮組織總RNA的提取

采用Trizol一步法提取比格犬下丘腦、垂體、卵巢、子宮總RNA。微量分光光度計測定A260、A280的吸光度值，準確定量總RNA的濃度和純度。取1 μg RNA用于1%瓊脂糖電泳，以檢測RNA的完整性。將RNA儲存于-80℃冰箱備用。按照ReverTra Ace(TOYOBO)試劑盒操作說明書，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-20℃冰箱中。

1.2.4 PCR擴增ERβ基因

ERβ基因擴增：模板為7丘(即7號犬下丘腦)cDNA，擴增體系25 μL如下：PCR 反應程序： 95℃預變性5 min；95℃變性30 s；56℃退火30 s；72℃延伸2 min；33個循環(huán)；最后延伸8 min。PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖電泳查看結果。

ERβ可能的兩個外顯子缺失篩查PCR反應：模板為ERβ全長PCR產(chǎn)物，引物為針對可能的外顯子缺失所設計，反應體系同ERβ基因擴增體系。

引物名稱引物序列(5、-3、)產(chǎn)物長度針對的外顯子Exon 1-3FATGGATATCAAAAACTCTCCA1/2/兩者Exon 1-3RGCATATGTAATCATTATG555 bp(1-555)Exon1-4FCCTGTAAACAGAGAGACACTG2/3/兩者Exon1-4RGGTCACGTGGCCACCATT408 bp(352-759)Exon2-5FTGGTCGTGTGAAGGATGTAAGGCC3/4/兩者Exon2-5RGAGCTCCACAAAGCCTGGAAT477 bp(490-966)Exon3-6FGTGAAGTGTGGCTCCCGGAGA4/5/兩者Exon3-6RCCCCTCATCCCTGTCCAG459 bp(643-1101)Exon4-7FTTCACCGAGGCCTCCATG5/6/兩者Exon4-7RCTTCCGGCTGCTCTCCGCCTCCTG411bp(865-1275)Exon 5-8FGACCACCCGGGCAAGCTCATC6/7/兩者Exon 5-8RCAGCAGCAGGTCGTAGACTGGGAC432 bp(1045-1476)Exon6-8FTGCGTAGAAGGAATTCTGGAA7/8/兩者Exon6-8RCCCGCGGAGTGTGTGCGC402 bp(1105-1506)Exon7-8FAAGGCCATGGTCCTCCTCAACTCC7/8/兩者Exon7-8RTCACTGAGATGTGGTCTTCTG393 bp(1201-1593)

PCR反應程序為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s；56℃退火30 s；72℃延伸30 s；33個循環(huán)；最后延伸8 min。PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖電泳查看結果。

1.2.5 PCR擴增產(chǎn)物的純化

PCR擴增產(chǎn)物的純化按照康為世紀公司DNA膠回收試劑盒回收相應目的片段，按照試劑盒說明書進行。純化后的PCR產(chǎn)物與pMD-18T載體連接，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物參照博邁德公司DH5α感受態(tài)細胞操作步驟進行轉(zhuǎn)化。菌液PCR鑒定陽性克隆。初步鑒定為陽性的菌液，提取質(zhì)粒送北京中科西林測序部測序鑒定。

2 實驗結果

2.1 比格犬下丘腦、垂體、卵巢、子宮組織總RNA的提取

比格犬下丘腦，垂體，卵巢，子宮組織總RNA提取(圖1)，ERβ的擴增及菌液鑒定(圖2)。

注：①F2犬下丘腦，垂體，卵巢，子宮，M: DL2000 DNA 標準分子量；② 3號犬卵巢與子宮，M: DL10000 DNA 分子量標準；③7號犬垂體與下丘腦。

注：①7號犬下丘腦，垂體；② F2犬子宮，卵巢，下丘腦，垂體；③PCR擴增產(chǎn)物菌液鑒定7號犬垂體與下丘腦；①②③中M均為DL2000 DNA 分子量標準。

比格犬下丘腦、垂體、卵巢、子宮組織總RNA的濃度測定結果見表1。

表1 下丘腦、垂體、卵巢、子宮總RNA濃度

由圖1及表1中結果可見，提取的組織總RNA 1%瓊脂糖電泳中28s和18s兩條核糖體RNA條帶清晰可見，比較完整，濃度測量純度較高，滿足后續(xù)基因擴增的要求。經(jīng)過預實驗確定，以F2丘(F2犬下丘腦cDNA)為模板擴增ERβ mRNA，以F2垂(F2發(fā)情期犬垂體)、7丘(7號犬下丘腦)cDNA為模板進行ERβ可能存在的兩個外顯子缺失剪接異構體的篩查。

2.2 ERβ基因測序結果

以7號犬下丘腦，垂體，2號發(fā)情犬(F2)下丘腦、垂體為模板進行擴大體積擴增，均在1000 bp～2000 bp之間有兩條帶，經(jīng)比對兩條帶都是比格犬ERβ 24轉(zhuǎn)錄本 mRNA序列，產(chǎn)物長度分別為1593 bp、1293 bp(比對結果此文未列出)。分析ERβ1593與ERβ1293的mRNA序列，后者在ERβ1593第一外顯子 ATG起始密碼子之前增加63 bp堿基，為載體序列，并且在第656-955位缺失300 bp，所缺失部分恰好是ERβ1593的第四外顯子的完整部分，推測是ERβ1593的一個剪接異構體。

2.3 ERβ可能的兩兩外顯子缺失篩查結果

2.3.1 引物篩查及可能的外顯子缺失異構體片段的篩查

所有引物以相同的模板，根據(jù)引物的Tm值，設計溫度梯度進行溫度梯度PCR，根據(jù)擴增產(chǎn)物對引物進行篩查(圖3)。

由擴增電泳圖可知，Exon1-4在48℃～58℃，Exon2-5在51℃～61℃，Exon4-7在52℃～64℃的溫度梯度內(nèi)的擴增產(chǎn)物均為單一條帶，或主帶之外有非常弱的非特異擴增帶(如1-4)，但不能后用于后續(xù)的回收純化連接及轉(zhuǎn)化，所以不能用于后續(xù)的可能的外顯子缺失型的剪切異構體的篩查，Exon1-3，Exon3-6，Exon5-8，Exon6-8可用于后續(xù)的篩查。用后面的這四對引物，由其最適擴增條件進行新一輪擴增(圖4-①)。

注：①引物1-3，1-4溫度梯度篩查：1～5由引物Exon1-3擴增，6～10由引物Exon1-4擴增；②引物2-5，3-6，4-7溫度梯度篩查：1～5由引物Exon2-5擴增，6～10由引物Exon3-6擴增，11～15由引物Exon4-7擴增；③引物5-8，6-8溫度梯度篩查：1～5由引物Exon5-8擴增，6～10由引物6-8擴增。M. DM2000 DNA 標準分子質(zhì)量。

注：1-3，3-6，5-8，6-8為引物代碼，M. DM2000 DNA 標準分子質(zhì)量。

Exon1-3擴增產(chǎn)物主帶為555 bp，與預期結果一致，主帶之上、之下各有一條可回收的非特異帶：1-3上、1-3下；Exon3-6擴增產(chǎn)物主帶為459 bp，與預期結果一致，主帶之下有一條可回收的非特異帶：3-6下；Exon5-8擴增產(chǎn)物主帶為432 bp，與預期結果一致，主帶之下有一條明顯的非特異帶：5-8下；Exon6-8擴增產(chǎn)物主帶為402 bp，與預期結果一致，主帶之下也有一條明顯的非特異帶：6-8下。將所擴增出的條帶進行回收純化(見圖4-②)，并測序比對鑒定。

2.3.2 ERβ外顯子缺失異構體片段的測序比對

由四對引物回收純化后的產(chǎn)物，測序后在NCBI網(wǎng)站上進行比對，均為比格犬ERβmRNA 部分CDS序列，經(jīng)DNDMAN軟件比對和手動校對后，獲得了比格犬ERβ的4個剪接異構體的部分序列。

Exon3-6引物所轄定的主帶序列與3-6下產(chǎn)物125 bp運用DNNMAN軟件比對后，有部分錯碼，經(jīng)手動校對，結果發(fā)現(xiàn)部分第4外顯子與部分第5外顯子缺失，缺失334 bp，缺失段為第4外顯子289 bp(陰影標示)和第5外顯子45 bp(下劃線標示)，是比格犬ERβ的一種剪接異構體形式，比對結果見圖5，圖6。

圖5 部分第4與部分第5外顯子缺失的DNAMAN比對

圖6 部分第4與部分第5外顯子缺失的手動比對

Exon3-6主帶與3-6下194 bp產(chǎn)物運用DNAMAN軟件比對后有部分亂碼，經(jīng)手動校對發(fā)現(xiàn)265 bp缺失，缺失段為部分第四外顯子(163 bp，陰影標示部分)與部分第五外顯子(102 bp，下劃線標示部分)。結果發(fā)現(xiàn)是另一種部分第4與部分第5外顯子組合缺失型的比格犬ERβ剪接異構體形式，比對結果見圖7，圖8。

圖7 部分第4與部分第5外顯子缺失的DNAMAN比對

圖8 部分第4與部分第5外顯子缺失的手動比對

Exon3-6主帶與3-6下159 bp產(chǎn)物運用DNAMAN軟件比對后也出現(xiàn)部分亂碼，經(jīng)手動校對發(fā)現(xiàn)300 bp缺失，缺失段為完整的第4外顯子序列，結合ERβ主基因的擴增，及ERβ1293的出現(xiàn)可判定ERβ第四外顯子缺失是比格犬ERβ基因的又一種剪接異構體形式，圖9，圖10。

圖9 第四外顯子完整缺失DNAMAN軟件比對

圖10 第四外顯子完整缺失的手動比對

圖11 第七外顯子完整缺失的DNAMAN軟件比對

Exon5-8主帶(432 bp)與5-8下回收產(chǎn)物(251 bp)運用DNAMAN比對時也出現(xiàn)部分序列亂碼，經(jīng)手工校對后發(fā)現(xiàn)了比格犬ERβ的第4種剪接異構體，選擇性剪接發(fā)生在第7外顯子上，缺失181 bp，是第7外顯子編碼序列的完整缺失，比對結果見圖11，圖12。

圖12 第七外顯子完整缺失的手動比對

圖13 第7外顯子完整缺失(引物Exon6-8)

Exon6-8主與6-8下比對也發(fā)現(xiàn)了第七外顯子(181 bp)的完整缺失，是ERβ基因的第七外顯子完整缺失型剪切異構體，比對結果見圖13。經(jīng)5`，3`RACE獲得了比格犬ERβ第七外顯子缺失剪切異構體的全長編碼序列ERβ1257，因第七外顯子的缺失使主基因發(fā)生了移碼突變，翻譯提前終止(測序結果此文未列出)。

結合DNAMAN軟件比對及手動校對結果，應用所涉及的兩兩篩查引物，本實驗共篩查出了比格犬ERβ的四個剪接異構體，分別為：第4外顯子完整缺失型剪接體；第4外顯子缺失289 bp與第5外顯子缺失45 bp(總計缺失334 bp)的組合缺失型剪接體Ⅰ；第4外顯子缺失163 bp與第5外顯子缺失102 bp(總計缺失265 bp)的組合缺失型剪接體Ⅱ；第7外顯子完整缺失型剪接體。對第4外顯子完整缺失及第7外顯子完整缺失的剪接異構體，研究小組通過5、-3、RACE獲得了全長序列，并構建了真核表達重組子，對其表達及功能進行了系列的研究[8-9]，而對于第4與第5外顯子部分缺失的兩種組合型缺失剪接異構體，本研究僅發(fā)現(xiàn)了部分編碼序列，并非全長CDS序列。

3 討論

比格犬ERβ位于8號染色體上(XM_861041.2，gene ID:403639)，全長1968 bp，CDS區(qū)1593 bp，編碼530個氨基酸(aa)[10]。本實驗在擴增比格犬ERβ全長序列時在主帶之下有一條明顯條帶，將兩條帶均回收純化克隆，得到兩個產(chǎn)物，一為ERβ1593，另一為ERβ1293，前者是比格犬野生型的ERβ，后者是比格犬ERβ的一種剪接異構體，其第四外顯子完整缺失。

針對ERβ的每一個外顯子，兩兩順次組合設計引物(每對引物包含兩個完整的外顯子)，進行擴增，對只能擴增出單一條帶的引物進行剔除，而對除目的條帶外，還能擴增出比較明顯的可以回收的非特異條帶(也可能是ERβ的一種剪接異構體)的引物，進行擴大體積擴增并回收純化克隆產(chǎn)物，測序后在NCBI網(wǎng)站比對，結果確定是目的基因的，再與主帶進行比對分析，如此我們得到了第4外顯子完整缺失的ERβ剪接異構體(缺失300 bp)，部分第4與部分第5外顯子組合缺失的兩個組合型缺失的ERβ剪接異構體(各缺失334 bp，265 bp)，以及第七外顯子完整缺失的ERβ剪接異構體(缺失181 bp)，根據(jù)實驗分析，及其它種屬的相關文獻報道[11-16]，比格犬ERβ還存在其它形式的剪接異構體，但因在不同的生理條件或者病理條件、不同的發(fā)育時期、不同的組織或不同的細胞內(nèi)，其表達時期及表達水平不同，所以對這些情況還需進行擴大堿基序列再次排查，該項工作課題組其它研究成員正在進行。

本研究中擴增出的比格犬ERβ mRNA CDS區(qū)第七外顯子(181 bp)完整缺失，導致ERβ閱讀框移位，使其在終止密碼子之前引入了10個非ERβ編碼的氨基酸殘基。該發(fā)現(xiàn)與Fitzgerald SD在ERα上的發(fā)現(xiàn)相似[17]。García Pedrero等[18]在多種正常組織和腫瘤中分離出了ERα的一種剪切異構體ER△E7，ER△E7第七外顯子完整缺失，失去了與p160輔激活因子(如SRC-1，AIB1)的雌激素依賴性的相互作用，ER△E7能以激素依賴的形式與 ERα 和ERβ 形成異源二聚體。本研究發(fā)現(xiàn)第七外顯子完整缺失的ERβ剪接異構體，所缺失的相應氨基酸編碼序列為409-469aa，是野生型ERβ配體結合區(qū)298-469aa中的部分序列，部分配體結合序列的缺失，是否引起該剪接異構體配體結合能力及信號轉(zhuǎn)導途徑的改變，以及缺失序列之后摻入的十個氨基酸殘基與野生型ERβ的配體結合區(qū)是否具有同源性等，對此還需進一步進行實驗驗證。

參考文獻：

[1] Gamba L, Cubedo N, Ghysen A,etal. Estrogen receptor ESR1 controls cell migration by repressing chemokine receptor CXCR4 in the zebrafish posterior lateral line system[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010 , 107(14):6358-6363.

[2] Kuiper GG, Carlsson B, Grandien K,etal.Comparison of the ligand binding specificity and transcript tissue distribution of estrogen receptors alpha and beta [J]. Endocrinology, 1997,138(3):8632-8701.

[3] Couse JF, Curtis Hewitt S, Korach KS. Receptor null mice reveal contrasting roles for estrogen receptor alpha and beta in reproductive tissues [J]. J Steroid Biochem Mol Biol, 2000, 74:287-296.

[4] Krege JH, Hodgin JB, Couse JF,etal. Generation and reproductive phenotypes of mice lacking estrogen receptor β[J]. Pro Natl Acad Sci USA, 1998, 95: 15677 - 15682.

[5] Ogawa S, Chester AE, Hewitt SC,etal. From the cover: abolition of male sexual behaviors in mice lacking estrogen receptors alpha and beta (alpha beta ERKO) [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97:14737-14741.

[6] 孔德強，李愛學，曾林，等. 一種比格犬雌二醇β受體剪切異構體的克隆和序列分析[J]. 中國比較醫(yī)學雜志, 2011, 21(7):44-47.

[7] 任秀梅，趙彥斌，孫兆增，等.比格犬一種新雌激素β 受體可變剪切體的克隆及鑒定[J]. 中國比較醫(yī)學雜志,2012,22(7):36-39.

[8] 甘藝，鐘睿，任秀梅，等. 比格犬ERβ1293基因真核載體的構建及其在HEK293T細胞中的表達和定位[J]. 中國比較醫(yī)學雜志,2014,24(2):7-10,15.

[9] 鐘睿，甘藝，趙彥斌，等. 比格犬雌激素β受體RNA干擾實驗細胞及PCR檢測引物的篩選[J]. 中國比較醫(yī)學雜志,2014,24(2):42-45,51.

[10] www.ncbi.nlm.nih.gov

[11] Poola I, Abraham J, Liu A. Estrogen receptor β splice variant mRNAs are differentially altered during breast carcinogenesis[J]. J Steroid Biochem Mol Bio,2002,l82:169-179.

[12] Poola I, Abraham J, Baldwin K,etal. Identification of ten exon deleted ERβ mRNAs in human ovary, breast, uterus and bone tissues: alternate splicing pattern of estrogen receptor β mRNA is distinct from that of estrogen receptor α. FEBS Lett,2002, 516:133-138.

[13] Friend K, Ang L, Shupnik M. Estrogen regulates the expression of several different estrogen receptor mRNA isoforms in rat pituitary[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1995, 93:5925-5930.

[14] Gunawan A, Kaewmala K, Uddin MJ,etal. Association study and expression analysis of porcine ESR1 as a candidate gene for boar fertility and sperm quality[J]. Anim Reprod Sci, 2011,128(1-4):11-21.

[15] Griffin C, Flouriot G, Buck VS,etal. Identification of Novel Chicken Estrogen Receptor-α Messenger Ribonucleic Acid Isoforms Generated by Alternative Splicing and Promoter Usage [J]. Endo, 1998, 139(11):4614-4625.

[16] Oliveira AG, Dornas RA, Mahecha GA,etal. Occurrence and cellular distribution of estrogen receptors ERα and ERβ in the testis and epididymal region of roosters[J]. Gen Comp Endocrinol, 2011, 170(3): 597-603.

[17] Fitzgerald SD, Allred D,etal. Inhibition of estrogen receptor action by a naturally occurring variant in human breast tumors[J]. Cancer Res,1992, 52:483-486.

[18] García Pedrero, Zuazua Pedro, Martínez-Campa Carlos,etal. The Naturally Occurring Variant of Estrogen Receptor(ER) ER△E7 Suppresses Estrogen-Dependent Transcriptional Activation by Both Wild-Type ERα and ERβ [J]. Endocrinology, 2003, 144(7):2967-2976.