人結腸癌細胞系綠色熒光蛋白裸鼠移植瘤模型的建立與觀察

胡文娟，梁 磊，尤金煒，方 天，劉 彪，陳 莉，賈春梅，許龍祥，惲時鋒

(南京軍區南京總醫院比較醫學科，全軍實驗動物科普與倫理教育基地，全國科普教育基地， 南京 210002)

動物模型是人類腫瘤學研究的重要工具之一，人類腫瘤裸鼠移植模型已成為腫瘤學研究的重要方法。在人類腫瘤移植于裸鼠受體前，遠期排斥作用和受體動物容易死亡是人類腫瘤異種移植成功率低的主要原因[1]。而且其還有操作復雜、觀察困難等缺點。如今，裸鼠已能夠廣泛應用于腫瘤模型的建立與研究。

GFP裸鼠是本科室將綠色熒光蛋白基因(green fluorescence protein，GFP)導入BALB/c nude小鼠而得來。GFP現已成為細胞生物學和分子生物學中應用最廣泛的分子標記之一。GFP裸鼠因自身含有標記蛋白與普通裸鼠相比而具有明顯的優勢，國內外目前關于普通裸鼠腫瘤模型的建立已有不少，但還未曾有使用GFP裸鼠建立腫瘤模型的例子。因此，將GFP裸鼠與普通裸鼠在腫瘤模型的建立方面做比較研究具有較大的科學意義。

1 材料和方法

1.1 實驗動物準備

分別取雌性SPF級裸鼠及GFP裸鼠(GFP nude)各10只，約為5～6周齡,體重15～20 g(裸鼠購于常州卡文斯實驗動物有限公司【SCXK(蘇)2011-0003】，GFP裸鼠為本科室提供【SCXK(軍)2012-0014】)，將實驗動物均置于無菌條件下飼養【SYXK(軍)2012-0047】，飼料和水自由攝入，嚴格滅菌處理，保持一定的溫度與濕度。

1.2 腫瘤細胞培養及收集

將人類結腸癌腫瘤細胞株KM12SM采用含10%胎牛血清的培養基，內含青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/mL，置37℃、5%CO2飽和濕度恒溫培養箱中培養。取處于對數生長期的細胞用胰酶消化制成單細胞懸液，離心3 min，棄上清液，經無血清的培養基液洗3遍次，細胞計數，加無血清培養基調整細胞濃度為1×107/mL。

1.3 動物模型構建

使用1 mL無菌注射器將細胞懸液分別注入GFP裸鼠及普通裸鼠右側腋窩皮下，每只實驗鼠的注射量為0.2 mL，約含細胞量2×106個。

1.4 成瘤情況觀察

實驗結束后，觀察兩組實驗鼠的一般情況(飲食、飲水、睡眠、排泄、活動狀態等)，成瘤時間(以肉眼可見瘤結節為標準)，每3 d測量并記錄實驗鼠的體重，測量瘤體長徑、短徑等，計算腫瘤體積(腫瘤體積=長徑×短徑2/2)，直至移植瘤全部壞死，繪制腫瘤生長曲線。

1.5 病理檢查

處死實驗鼠，剝取腫瘤組織及周圍淋巴結，置于4%多聚甲醛中固定，常規石蠟包埋切片，HE染色，顯微鏡下觀察腫瘤組織生長、浸潤及轉移情況。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 一般情況觀察

GFP裸鼠與裸鼠均未見死亡，成瘤率100%。實驗初期兩組實驗鼠精神狀態較好，飲水、飲食正常，反應敏捷；隨著后期瘤體的增大，均出現進食，活動減少，反應遲鈍等現象，裸鼠體重下降較為明顯。

2.2 腫瘤出現時間

GFP裸鼠組于接種后4～5 d在右前肢腋窩皮下長出肉眼可見的腫瘤，裸鼠組于接種后6～8 d在腋下長出可見腫瘤，差異顯著。

2.3 腫瘤生長情況

實驗鼠均長出肉眼可見的移植瘤，外觀呈現不規則狀，質地較硬，活動性好，與周圍組織界限較清楚，并隨著時間的推移而逐漸增大。根據表1及圖1(腫瘤生長曲線圖)顯示，接種第16天開始，兩組實驗鼠測得的腫瘤體積存在顯著差異(P< 0.05)，在成瘤后腫瘤生長速率方面，GFP裸鼠腫瘤生長速度比裸鼠要快；在接種第20天，裸鼠組測得體積約為(3463.43±341.39)mm3，GFP裸鼠組腫瘤體積約為(4923.46±521.72)mm3，存在顯著差異(P< 0.05)。據圖2可直觀的看出GFP裸鼠移植腫瘤生長情況優于裸鼠。圖1,圖2彩插4。

表1 GFP裸鼠與裸鼠皮下腫瘤的體積分析

2.4 腫瘤組織病理學觀察

實驗鼠處死后，取瘤體觀察，均為球形結節狀，腫瘤為非浸潤生長；瘤體有完整的包膜包裹，與周圍組織分界清晰，容易分離，剖面呈魚肉狀，血供豐富，瘤塊中央可見局灶性壞死，GFP裸鼠瘤體體積比裸鼠瘤體更大一些。HE染色顯示腫瘤細胞排列緊密，瘤細胞生長活躍，大小較為均勻，核質深染，染色質粗，部分區域可見腺腔形成。根據圖3、圖4所示(彩插4)，GFP裸鼠移植瘤瘤細胞比裸鼠瘤細胞排列更加緊密，可見瘤細胞生長情況更為活躍。腫瘤細胞分泌粘液，并侵犯周邊結締組織。

3 討論

腫瘤已成為當前威脅人類最嚴重的常見病之一，每年死于腫瘤的人數以百萬計，因此，建立腫瘤模型，進行防治研究，是基礎醫學研究中的重要課題[2]。腫瘤模型對研究腫瘤的病因、發病機制、抗癌藥物篩選機腫瘤防治等具有非常重要的意義[3]。腫瘤分子生物學的迅猛發展迫切需要簡便快速、成瘤時間短和穩定性好的動物模型，以此作為研究平臺進行后續的藥物或其他實驗研究[4]。皮下移植瘤種植操作較為簡便，創傷小，且易于測量瘤體直徑，因此本實驗采取皮下移植瘤這一動物模型制作方法進行研究比較。理想的腫瘤動物模型應具備以下條件：(1)致癌方法簡便易行；(2)經濟快速；(3)指標客觀明確；(4)對癌變器官的特異性高；(5)重復性好；(6)誘發腫瘤的病理類型、生物學行為、電鏡下表現及組織化學改變應與人體腫瘤相似[5]。結腸癌動物模型也應如此。

本實驗采用細胞懸液直接腋窩皮下注射的方法分別構建了GFP裸鼠及裸鼠結腸癌動物模型。GFP裸鼠組與裸鼠組均未見死亡，平均成瘤率100%，GFP裸鼠組于接種后4～5 d在右前肢腋窩皮下長出肉眼可見的腫瘤，裸鼠組于接種后6～8 d在腋下長出可見腫瘤，存在顯著差異。隨著后期瘤體的增大，兩組均出現進食，活動減少，反應遲鈍等現象，GFP裸鼠組的精神狀態較裸鼠組稍好一些。從接種第16天開始，兩組實驗鼠測得的腫瘤體積存在顯著差異(P< 0.05)，在接種第20天，裸鼠組測得體積約為(3463.43±341.39)mm3，GFP裸鼠組腫瘤體積約為(4923.46±521.72)mm3，存在顯著差異(P< 0.05)。根據腫瘤生長曲線，可直觀顯示成瘤后腫瘤生長速率方面，GFP裸鼠腫瘤生長速度比裸鼠要快。這些數據與廖前進[6]等報道的數據存在差異，可能與小鼠的品種，測量方法及生長環境等有關。

綜上所述，可見GFP裸鼠在成瘤時間，精神狀態，腫瘤質量等方面與裸鼠相比，具有一定的優勢，腫瘤生長曲線圖也可直觀的看出GFP裸鼠組腫瘤生長情況優于裸鼠組。由于GFP裸鼠將綠色熒光蛋白基因導入BALB/c nude小鼠，使得自身含有標記蛋白，綠色熒光蛋白基因的導入可能改變了GFP裸鼠的蛋白表達，造成GFP裸鼠免疫功能與裸鼠比更為低下，還有待以后的進一步比較研究。通過本實驗比較研究，我們可以看出GFP裸鼠較裸鼠而言，可為結腸癌淋巴轉移的機制探討和診斷治療研究提供更為理想的動物模型。

參考文獻：

[1] 梁文豐，鄭琳，馮韻恬，等. PDTX裸鼠模型研究進展[J]. 中國科技論文在線精品論文. 2014,7(5)：398-402.

[2] 趙勇，伍靜，毛峰峰，等. 裸鼠荷瘤實驗中常見問題的解析和總結[J]. 中國比較醫學雜志. 2012,22(7)：17-20.

[3] 李桂園，陳龍邦、臧靜，等. C57BL/6小鼠黑色素瘤B16細胞株在ICR小鼠腫瘤模型的建立[J]. 醫學研究生學報. 2003,16(4)：262-266.

[4] 唐楊琛，沈干，胡世蓮，等. 兩種方法建立人胃癌裸鼠移植瘤模型的比較[J]. 中國臨床保健雜志. 2013，16(2)：180-182.

[5] 李友堂，李鴻茹，陳穎，等. 人肺腺癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立[J]. 福建醫藥雜志. 2010,32(1)：80-82.

[6] 廖前進，蘇堅，何潔，等. DADS對人結腸癌SW480細胞裸鼠致瘤的影響[J]. 實用癌癥雜志. 2010,25(3)：225-227.