Alpha-亞麻酸對HepG2細胞脂肪酸合成關鍵基因的影響

李 微，張 濤，解現星，孟 威，劉慧芳，肖霖力，李春風，劉 源

(1.中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，北京 100071；2. 吉林大學動物科學學院，長春 130062；3. 青島農業大學動物科技學院，山東 青島 266109；4. 北京農學院動物科學院，北京 102206)

隨著社會的發展、人們生活水平的提高和生活方式的改變，熱量攝入增加、體力活動減少及肥胖不斷流行，脂代謝紊亂發生率逐年攀升。流行病學調查資料顯示我國目前有高血壓患者1.6～2億。脂代謝紊亂已成為重大衛生問題，引起了世界各國的廣泛關注。長期飽和脂肪酸飲食是脂代謝紊亂發生的重要原因之一，飽和脂肪酸攝入量過高可導致血清中膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇升高，繼而引發脂肪肝、動脈粥樣硬化、冠心病等疾病。

研究表明飽和脂肪酸抑制SREBP1活性，從而抑制脂肪酸的合成[1]，SREBP1C是固醇調節元件結合蛋白家族成員，屬核轉錄因子，是脂肪酸合成關鍵調控基因之一，前體SREBP經過剪切成為成熟SREBP[2]，核內SREBP的穩定性受泛素化[3]、磷酸化和乙酰化的調節[4]。成熟型SREBP1C調節ACC及FAS表達，乙酰輔酶A羧化酶(ACC) 催化乙酰輔酶A生成丙二酰輔酶A，是脂肪酸合成限速酶，脂肪酸合成酶(FAS)是脂肪酸合成的主要限制酶，催化丙二酰輔酶A生成軟脂酰輔酶A的全部過程。大量研究表明多不飽和脂肪酸(PUFA)不僅是細胞的能量來源及組成成分，同時也是重要的調節物質，調控營養代謝疾病(如糖尿病、冠心病等)的發展過程[5]，臨床試驗證明高甘油三酯血癥患者(≥500 mg/dl)每天服用n-3PUFA約4 g能夠使血清甘油三酯水平降低45%[6]。ALA為由食物提供的植物來源n-3PUFA，主要存在于植物的種子、果實及其油脂中，在體內可經生物化學途徑合成EPA和DHA。ALA可降血脂但不引起肝臟積累脂質，對脂代謝紊亂引起的疾病有重要預防和治療意義。本研究旨在探討不同劑量ALA對飽和脂肪酸處理后的肝細胞脂肪酸合成的影響，對闡明ALA在脂肪酸合成及脂肪肝形成的作用有重要意義。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞及分組

人肝癌母細胞HepG2細胞由軍事醫學科學院微生物所細胞庫贈予。細胞分組：不加替代物的對照組(NC)，加含0.5 mmol/L硬脂酸的培養液培養的高脂組(HF)，和以ALA代替硬脂酸，代替比例分別為10%、20%、50%、70%、100%的ALA替代組。

1.2 儀器及試劑

DMEM高糖培養基(Gibco,USA)；胎牛血清(Hyclone,USA)；硬脂酸、ALA(sigma aldrich,USA)；反轉錄試劑盒(TaKaRa DRR037A，Japan)；BIO-RAD IQ5 real-time PCR儀；蛋白酶抑制劑(Roche, Switzerland)；小鼠抗人β-actin(abcam, UK)、兔抗人SREBP1c(abcam, UK)、小鼠抗人FAS抗體(abcam, UK)；辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠抗體(中衫金橋,China)、山羊抗兔抗體(中衫金橋,China)；Western blotting發光檢測試劑盒(英格恩,China)；蛋白質預染 marker(Fermentas)；X光膠片、顯影液、定影液(Kodak,USA)。

1.3 細胞處理方法

HepG2 細胞、培養于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基，置于5% CO2、37℃培養箱中培養。收集對數生長期HepG2細胞，以0.25%胰酶消化后制成細胞懸液，并接種于10 cm培養皿中，5% CO2、37℃培養箱中培養。細胞貼壁后加入含0.5 mmol/L硬脂酸的培養液培養36 h，收集細胞用于基因表達檢測。之后加入不同替代濃度ALA代替硬脂酸培養36 h后收集細胞用于基因和蛋白表達檢測。

1.4 測定指標

1.4.1 實時定量PCR：每皿細胞加入1 mL Trizol后用細胞鏟鏟下細胞，收集于2 mL離心管，室溫放置10 min，充分裂解后按照Trizol操作說明步驟提取細胞總RNA。反轉錄體系為20 μL，每管加入總RNA 1 μg，按照TaKaRa DRR037A反轉錄試劑盒操作，37℃反應30 min，85℃ 5 s。反轉錄后的cDNA用于實時定量PCR反應，引物由北京博邁德公司合成，其中SREBP1C上游引物：5′-GTGGCGGCTGC ATTGAGAGTGAAG-3′，下游引物：5′-AGGTACC CGAGGGCATCCGAGAAT-3′，產物長度：362 bp，退火溫度：66℃；FAS上游引物：5′-CAAGAACTGCA CGGAGGTGT-3′，下游引物：5′-AGCTGCCAGAG TCGGAGAAC-3′，產物長度：569 bp，退火溫度：60℃；ACC上游引物：5′-GCTGCTCGGATCACTA GTGAA-3′，下游引物：5′-TTCTGCTATCAGTCTGT CCAG-3′，產物長度：339 bp，退火溫度：56℃；β-actin上游引物：5′-TTCTGCTATCAGTCTGTCCAG-3′，下游引物：5′-TTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3′，產物長度：156 bp，退火溫度：56℃。反應體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×) 12.5 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL(10 pmol)，加入dH2O至25 μL。反應條件：95℃預變性30 s，進行40個循環，每個循環包括95℃變性30 s，各退火溫度退火30 s，72℃延伸1 min；然后72℃反應10 min，95℃作用30 s，60℃作用1 min；60℃作用20 s，該步進行70個循環。每個樣品設置3個重復，同時空白對照及5倍梯度稀釋進行反應。引物擴增效率分別為107.6%(SREBP1C)，122.7%(FAS)，98.7%(ACC)，106.2%(β-actin、56℃)，99.4%(β-actin、66℃)，104.1%(β-actin、60℃)。

1.4.2 Western Blotting檢測：分別提取各組細胞總蛋白，進行10% SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白轉移至PVDF膜，5% 脫脂奶粉封閉，分別用β-actin、SREBP1C，FAS，ACC抗體檢測蛋白表達。其中β-actin作為內參。

1.5 統計學方法

用SAS 9.0軟件對數據進行統計分析，對照組與高脂組應用成組設計T檢驗分析數據，高脂組與ALA處理組間差異采用單因素多水平方差分析。

2 結果

2.1 基因表達

2.1.1 硬脂酸培養細胞基因表達

與對照組相比，高脂組SREBP1C、FAS、ACC均出現顯著升高(P< 0.001)(表1)。

表1 HepG2細胞脂肪酸合成基因相對表達量

2.1.2 ALA替代基因表達

ALA替代各組SREBP1C表達均顯著低于高脂組(P< 0.001)，且呈現濃度依賴性，即ALA替代比例越高對SREBP1C表達抑制作用越強；0.5 mmol/LALA組及0.35 mmol/L組FAS表達顯著低于高脂組(P< 0.001)，其余各組均低于高脂組，但無統計學差異；0.1 mmol/L ALA替代ACC基因表達略增強，其余各組呈現抑制趨勢，但ACC表達則無統計學差異(圖1)。

圖1 ALA替代培養HepG2細胞SREBP1C、FAS及ACC基因表達

2.2 蛋白表達

ALA替代各組脂肪酸合成基因SREBP1C、FAS蛋白表達降低，且呈現濃度依賴作用，即隨著替代比例上升，蛋白表達抑制作用也上升；而ACC則無明顯差異。

圖2 ALA替代培養HepG2細胞SREBP1C、FAS及ACC蛋白表達

3 討論

飽和脂肪酸可導致脂質代謝相關基因異常，并一定程度上損害肝細胞，研究顯示飽和脂肪酸可通過激活Caspase-3和Caspase-9引起L02細胞凋亡[7]。飽和脂肪酸影響肝細胞脂肪沉積，肝細胞中脂肪沉淀過多可能導致脂肪肝。研究表明飽和脂肪酸可通過抑制AMPKa-2 mRNA表達，調整HL mRNA的表達來抑制HepG2細胞內肝脂肪酶HL活性，減少肝細胞脂肪分解作用，使脂肪在HepG2細胞內堆積[8]。本實驗中硬脂酸處理HepG2細胞后FAS、ACC及SREBP1C基因mRNA水平升高顯著，可見硬脂酸促進HepG2細胞脂肪酸合成基因表達，促使HepG2細胞脂肪酸合成增加，而脂肪酸合成增加可加重肝細胞脂肪沉積，進而形成脂肪肝。

Mater, M. K等[8]研究表明PUFA能夠降低肝臟SREBP1C基因mRNA水平，同時可抑制SREBP1C蛋白表達。Fukumitsu.S等[9]利用ALA干預3T3-L1脂肪細胞時發現，300 μmol/L ALA干預后SREBP1C及FASmRNA表達顯著降低，這與本實驗結果吻合，本實驗中ALA各組SREBP1C表達均顯著低于飽和脂肪酸組(P< 0.001)，蛋白表達表現出相同的濃度敏感性，可見ALA可以緩解由飽和脂肪酸導致的脂肪酸合成基因SREBP1C表達上調，且SREBP1C對ALA替代存在濃度依賴。SREBP1是固醇調節元件結合蛋白家族成員，屬核轉錄因子，Yahagi.N等[10]通過過表達SREBP1基因小鼠與野生型小鼠進行比較發現，飼喂不飽和脂肪酸能夠使野生型小鼠成熟型SREBP1減少，而前體未見減少，FAS、ACC表達降低，但轉基因小鼠則無此反應，該現象證實成熟型SREBP1調控著FAS、ACC的表達。

脂肪酸合成酶(FAS)是脂肪酸合成限制酶，催化棕櫚酸酯從頭合成的所有步驟[11]。0.5 mmol/L ALA組、0.35 mmol/L ALA組FAS表達顯著低于飽和脂肪酸組(P< 0.001)，各濃度ALA組蛋白表達呈現濃度依賴性降低，這說明ALA可緩解由飽和脂肪酸導致的FAS升高，替代濃度越高緩解作用越明顯。另有研究表明ALA 能夠使高脂飲食或者添加肝臟X受體LXR激動劑的大鼠肝臟脂肪沉積減輕，并抑制SREBP1C表達[12]，SREBP1C能夠被LXR調節，二者均能夠調節FAS表達[13]，故ALA可緩解飽和脂肪酸促進作用，能夠通過不同途徑抑制SREBP1C及FAS表達。

本實驗中HepG2細胞ALA各濃度組結果顯示ACC基因和蛋白表達表達均無明顯差異，即ALA對于緩解由硬脂酸導致的ACC基因表達增強作用不明顯。Shen.Q.W等[14]用ALA處理 C2C12細胞發現ALA可通過促進AMPKα磷酸化間接激活ACC，使后者表達加強，與本實驗研究結果不同可能與選取的細胞類型及處理方式有關。

綜上，硬脂酸處理后HepG2細胞脂肪酸合成關鍵基因mRNA表達增強，隨著ALA替代硬脂酸濃度升高，ALA對脂肪酸合成關鍵基因SREBP1C及FAS表達的抑制作用增強，ALA能夠緩解硬脂酸的表達促進作用，但ACC表達無明顯差異。

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