莫諾苷對局灶性腦缺血再灌注大鼠Wnt7a和APC表達的影響

薛金龍，孫芳玲，劉婷婷，侯虹麗，魏仁平，向本旭，艾厚喜，王玉蘭，張 麗，石淑先，王 文

(1．北京化工大學材料科學與工程學院，北京 100029；2．首都醫科大學宣武醫院藥理研究室，北京 100053；3．河北北方學院，河北 張家口 075000)

腦血管病(cerebral vascular diseases，CVD)是危害人類健康和生命的三大疾病之一，而缺血性腦血管病(ischemic cerebralvascular disease，ICD)更是占了其中的50%以上。缺血性腦損傷病理機制復雜，一直是神經科學領域研究的熱點。Wnt信號通路是調控細胞生長增殖分化的關鍵途徑，在大腦的可塑性中起至關重要的作用。此前對于Wnt信號通路在神經發生的作用已經有了一定的研究，最近研究表明，Wnt 信號通路在缺血性腦損傷的修復過程中和神經血管穩態重構中作用機制明顯[1]。Wnt7a是Wnt信號通路上游重要配體，對調解Wnt信號通路作用關鍵，并且Wnt7a 可以調節加速細胞的生長和分化的進程，抑制神經膠質再生[2]。APC是Wnt信號通路的抑制劑，可以通過抑制Wnt信號通路的激活調節細胞的增殖分化[3]。

中藥山茱萸是山茱萸科植物山茱萸(cornus offcinalisSieb.et Zucc)的干燥成熟果肉，具有補肝益腎、澀精固脫的作用。本實驗室對其有效成分山茱萸環烯醚萜苷進行進一步分離，得到單體化合物莫諾苷(morroniside)。我們的前期研究發現，莫諾苷能減小局灶性腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積，增強皮層抗氧化、抗炎和抗凋亡能力[4-9]，并在體外和體內實驗對血小板聚集有一定抑制作用[10-13]。我們推測莫諾苷對缺血性腦損傷有神經保護作用，并且能夠促進缺血性腦損傷的神經修復。本文通過體內實驗研究莫諾苷對缺血性腦損傷大鼠皮層Wnt7a和APC含量的影響，初步探討莫諾苷促進缺血性腦損傷后神經發生的機制。

1 材料和方法

1.1 動物

SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠50只，體重250～280 g，購自北京斯貝福實驗動物科技有限公司【SCXK(京)2011-0004】。由首都醫科大學宣武醫院SPF級實驗動物室常規飼養【SYXK(京)2010-0013】，自由進食進水，溫度25±1℃，相對濕度55±5%。

1.2 藥物

莫諾苷：由本室從山茱萸中提取制備，采用高效液相分析，純度約98.5%，蒸餾水溶解配制新鮮溶液。

1.3 試劑和儀器

一抗Anti-APC antibody(批號：ab40778)，Abcam(香港)；一抗 Anti-Wnt7aantibody(批號：ab100792)；小鼠抗β-catenin一抗(批號：TA09)；山羊抗鼠IgG(批號：ZB-2010)和山羊抗兔IgG(批號：ZB-2301)，北京市中杉金橋生物技術有限公司。

超聲波細胞破碎粉碎機：JY92-II型，寧波市新芝科技研究所；臺式微量冷凍離心機：Microfuge 22R，美國Beckman Coulter公司；電泳儀：Bio-Rad 043BR1549，美國BIORAD公司；小型垂直電泳槽：1658004，美國BIORAD公司；高分辨率多模式分子成像系統：Image Station 4000R，美國Carestream Health公司；全波長酶標儀：Multiskan Spectrum，美國Thermo Fisher公司。

1.4 方法

1.4.1 模型制備

采用Longa等[14]所介紹的大腦中動脈線栓模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)并稍加改進。大鼠術前禁食12 h。10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉后，切開右側頸部，沿胸鎖乳突肌分離肌肉和筋膜，暴露右側頸總動脈。分離右側頸外動脈和頸內動脈。于近心端結扎頸總動脈，且在頸總動脈分岔處結扎頸外動脈。動脈夾夾閉頸內動脈，在近心端距頸總動脈分岔約4 mm處用眼科剪剪一斜行細小動脈切口，將直徑0.28 mm的栓線從頸總動脈插入頸內動脈約18 mm，此時栓線已進入大腦中動脈，到達大腦前動脈起始部，阻斷大腦中動脈的所有血供，造成大腦中動脈供血相關區的梗死灶。栓塞30 min后緩慢拔出栓線，實現再灌注。假手術組只分離動脈結扎，不插線。

1.4.2 分組及給藥

大鼠蘇醒后提尾時出現對側前肢內收屈曲，爬行時向對側轉圈，站立時向對側傾倒等癥狀即為MCAO模型成功。隨機將MCAO成模大鼠分為：模型組，莫諾苷小、中、大高劑量組(30 mg/kg，90 mg/kg，270 mg/kg)，每組10只。采用灌胃給藥，每天1次，連續給藥7 d。假手術組和模型組給予蒸餾水灌胃。

1.4.3 western-blot 分析Wnt7a和APC 蛋白表達

取新鮮大鼠右側皮層腦組織裂解提取蛋白，進行SDS-PAGE 電泳(分離膠10%，濃縮膠5%)，每孔加入50 pg蛋白質，先恒壓70 V電泳40 min；然后恒壓100 V 電泳至分離膠底部，電轉移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入1∶1000 稀釋的兔抗大鼠APC 單克隆抗體和1∶500稀釋的兔抗大鼠Wnt7a多克隆抗體，4℃過夜，TBST 洗滌3 次，每次10 min，再加入1∶2000稀釋的羊抗兔IgG-HRP，室溫搖床孵育2 h，TBST 洗滌3次，ECL試劑顯色、曝光并拍照，以β-actin作為內參，將曝光后的圖片導入軟件Quantity One中分析。實驗重復3次。

1.3 統計學處理

采用SPSS 13．0 軟件進行處理，實驗數據均以(x±s)表示，組間比較采用ANOVA 方差分析和t 檢驗，以α=0.05 為檢驗水準。

2 結果

2.1 免疫印跡法觀察莫諾苷對缺血性腦損傷后Wnt7a表達的影響

造模后7 d，模型組大鼠大腦皮層Wnt7a蛋白表達水平比假手術組升高(P< 0.01)；與模型組相比，莫諾苷大劑量組(270 mg/kg)大鼠大腦皮層Wnt7a蛋白表達水平升高顯著，差異有統計學意義(P< 0.01)(圖1，表1)。

圖1 免疫印跡檢測缺血性腦損傷大鼠皮層Wnt7a表達

表1免疫印跡法檢測Wnt7a表達變化統計結果

Tab.1The statistical results of Wnt7a expression changed by western blot

注： n=5，Meam±S.E.M. ** P < 0.01與模型組相比； ## P < 0.01，與假手術組相比。

2.2 免疫印跡法觀察莫諾苷對缺血性腦損傷后APC表達的影響

造模7 d后，模型組大鼠大腦皮層APC蛋白表達水平比假手術組顯著降低(P< 0.001)；與模型組大鼠相比，莫諾苷小、中、大劑量組(30 mg/kg, 90 mg/kg, 270 mg/kg)大鼠大腦皮層APC蛋白表達水平均降低顯著，差異有統計學意義(P< 0.001,P< 0.001,P< 0.001)(圖2，表2)。

3 討論

腦卒中有著高發病率、高死亡率、高致殘率、高復發率的特點，給社會和家庭造成巨大負擔，研發有效的治療缺血性腦損傷的藥物至關重要，也是今后發展的必然趨勢。

圖2 免疫印跡檢測缺血性腦損傷大鼠皮層APC表達

表2免疫印跡法檢測APC表達變化統計結果

Tab.2The statistical results of APC expression changed by western blot

注：n=5，mean±S.E.M。*P < 0.05，*** P < 0.001與模型組相比；### P < 0.001，與假手術組相比。

Wnt信號通路是廣泛存在于多細胞真核生物中的信號通路，是調控細胞生長增殖分化的關鍵途徑并且調節成年神經發生[15]，并與腦缺血后的神經修復有著密切的聯系。很有可能作為藥物促進腦缺血損傷后神經修復的靶點之一。

在Wnt信號通路中Wnt7a配體與細胞膜上的Fzd結合，聯合低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(LRP5/6)可以激活Wnt信號通路[16]。Wnt7a 具有促進突觸發生的作用，在體外對大腦顆粒細胞神經元培養的試驗中發現，Wnt7a 的提高可以通過軸突微管的重構導致軸突的擴展和分支；并能促進小腦皮層中的小腦粒細胞和苔蘚纖維之間突觸聯系成熟[17]。Wnt 7a促進皮質層神經細胞的分化和前體細胞的自我更新能力[18]。

在Wnt 信號通路中，APC蛋白與β-連環蛋白(β-catenin)的穩定性密切相關，APC調節β-catenin的含量，控制相關轉錄過程。APC會與β-catenin結合，促使細胞核內β-catenin運出，減少β-catenin/TCF結合，抑制轉錄過程。Wnt-7a可誘導APC蛋白從β-catenin細胞質絡合物上解離[19]。另外，Sierra等[20]研究發現，APC會破壞Axin和Gsk-3β組成的降解復合體，從而促使β-catenin降解。因此作為Wnt信號通路的抑制劑[21]，APC含量的增加會抑制Wnt通路激活而調節細胞的增殖分化。

本文采用免疫印跡法檢測MCAO模型大鼠大腦皮層Wnt7a和APC的表達，發現造模7 d后，模型組大鼠大腦皮層Wnt7a的表達比假手術組顯著升高，APC表達顯著下降，表明MCAO造模后激活了Wnt信號通路。大量研究表明腦梗死可激發短暫和微弱的內源性代償性修復機制[22]，其中Wnt信號通路被激活很可能是所涉及的修復機制之一。李等[23]發現腦缺血7 d后海馬區的Wnt7b和β-catenin表達量均明顯增加，也提示在成年大鼠腦缺血損傷后可內源性激活Wnt信號通路。但腦缺血后短暫的應激修復機制不足以最終修復神經血管的損傷，需要外源性藥物的干預治療。我們發現給予莫諾苷治療7 d后，Wnt7a表達量較模型組相比明顯上升，APC的表達則顯著降低，表明莫諾苷很可以通過促進Wnt7a的表達、抑制APC的表達來進一步激活Wnt信號通路，并進一步發揮保護神經，促進神經發生的作用。由于Wnt通路的調節機制比較復雜，莫諾苷如何通過調節Wnt信號通路來促進腦缺血后的神經恢復，需要進一步實驗研究。

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