肥胖對小鼠十二指腸DMT1和FPN1表達的影響

高 倩，李 蔓，張萬山，魏守剛

(1.首都醫科大學公共衛生學院兒少衛生與婦幼保健學系，北京 100069；2.首都醫科大學，環境毒理學北京市重點實驗室，北京 100069)

肥胖癥已成為世界范圍內危害人體健康、影響生命質量、增加社會醫療負擔的現代流行性疾病[1]。鐵是人體一種必需微量元素，鐵缺乏可造成免疫損傷，運動能力下降等危害。近年來的許多研究發現，肥胖患者比正常體重人群更易發生鐵缺乏[2]。肥胖與鐵缺乏集于一身，將對機體帶來雙重危害，嚴重影響人體尤其是兒童的健康。一些研究表明，肥胖兒童鐵的需要量并無增加，膳食鐵的攝入量和生物利用度也不低[3]，肥胖兒童對穩定性同位素示蹤鐵的膳食吸收率顯著低于正常對照兒童[4]，提示我們膳食鐵吸收不良是導致肥胖性鐵缺乏發生的原因。十二指腸是鐵吸收的主要部位，十二指腸中有兩種主要鐵吸收分子即二價金屬離子轉運體(divalent metal transporter 1,DMT1)和膜鐵轉運蛋白(ferroportin 1,FPN1)對鐵的吸收發揮起直接調控作用。目前國內外有關肥胖對腸鐵吸收影響機制的研究較少，相關鐵吸收分子在肥胖機體內如何調節鐵的吸收尚不清楚。因此本實驗以高脂膳食建立小鼠肥胖模型，采用實時熒光定量PCR和Western blot法分析營養性肥胖對小鼠十二指腸DMT1、FPN1mRNA及蛋白表達的影響，初步探討肥胖影響鐵吸收的機制，為今后有效預防和治療肥胖性鐵缺乏提供理論和實驗依據。

1 材料和方法

1.1 動物分組及處理

4周齡雌性C57BL/6J小鼠12只，體重10～13 g，由軍事醫學科學院實驗動物中心提供【SCXK(軍)2012-0004】。動物飼養于首都醫科大學實驗動物中心【SYXK(京)2010-0022】。以普通飼料適應性喂養1周后，將小鼠隨機分為2組，即正常對照組和肥胖模型組，每組6只。對照組小鼠繼續飼以普通飼料，模型組飼以經輻照消毒的特制高脂鼠料，配方為基礎飼料79%、豬油10%、蛋黃粉10%、膽固醇1%(軍事醫學科學院實驗動物中心提供)，飼養期14周，每周測體重1次。

飼養建模結束后，用10%水合氯醛按400 mg/kg體重腹腔注射麻醉小鼠，開腹剪取十二指腸，液氮中速凍保存，用于后續實驗檢測。

動物飼養及實驗符合《實驗動物管理條例》，并經首都醫科大學倫理委員會許可。

1.2 實時熒光定量PCR法檢測DMT1、FPN1 mRNA含量

取凍存十二指腸組織100 mg，Trizol法提取總RNA，用紫外分光光度計測量260 nm、280 nm波長處的吸光度值，計算A260/A280和RNA濃度。取5 μL RNA進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA的完整性。參照DNase Ⅰ試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)對RNA中殘留的基因組DNA進行消化處理，在2 μg總RNA樣本中加入DNase I 2 μL，10×緩沖液2 μL，無RNase水至20 μL，37℃孵育30 min后，加入2 μL 200 mmol/L EDTA終止反應，65℃孵育10 min。處理后的總RNA樣品用HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒(北京康為)進行反轉錄，cDNA合成反應體系(20 μL)：2 μL Primer mix(Oligo dT引物，隨機引物)，5×緩沖液4 μL，0.1 mmol/L DTT 2 μL，10 mmol/L dNTP 1μL，消化后的RNA 10 μL，200 μmol/L HiFi-MMLV 反轉錄酶1 μL，加無RNase水至20 μL。反應條件: 37℃孵育50 min，70℃孵育10 min。反應產物置于-20℃冰箱保存。

用熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)按照Ultra SYBR Mixture PCR 試劑盒(北京康為)進行擴增。目的基因和內參基因的引物序列如下：(1)DMTI 上游5′-GCGCTCTTTGTTTCCTTCAT-3′，下游5′-TTGTCACTGGGAAAGAGGTC-3′，擴增片段長度140 bp；(2)FPN1上游5′-CCCTTCCGC ACTTTCCGAAT-3′，下游5′- GAGAATAGACC AGTCCGAACAAGGC-3′，擴增片段長度257 bp；(3)β-actin上游5′-GCCTTCCTTCTTGGGTAT-3′，下游5′-GGCATAGAGGTCTTTACGG-3′，擴增片段長度97 bp。20 μL擴增反應體系包括: 2×Ultra SYBR Mixture 10 μL，0.4 μL上游引物10 μmol/L，0.4 μL下游引物10 μmol/L，2 μL cDNA 10 μmol/L，加入滅菌蒸餾水至20 μL。擴增程序為：95℃預變性10 min，(95℃ 15 s，60℃ 60 s)×45個循環。每個樣品同時做3個重復。試驗結果按照2-ΔΔCt相對定量公式計算即ΔCt=Ct目的基因-Ct內參基因，ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct內參基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct內參基因)對照組，將對照組小鼠mRNA表達水平定為1，分析模型組和對照組不同基因表達的差異。

1.3 Western blot法檢測FPN1蛋白的表達

應用RIPA試劑提取組織蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取等量蛋白質采用12%SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜至NC膜，麗春紅染膜。室溫封閉(3%BSA，TBST稀釋)30 min，然后加入兔抗FPN1多克隆抗體(英國Abcam公司，1∶2000)，4℃過夜。次日TBST洗膜后加入1:5000 辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG(H+L)抗體(北京天德悅生物科技有限公司)，室溫搖動孵育40 min。使用ECL試劑盒發光顯影，膠片曝光。以GAPDH作為內參，相同實驗重復3次。膠片曝光結果掃描輸入計算機后，用TotalLab Quant凝膠成像分析軟件分析處理，以目的蛋白與內參蛋白的積分光密度(integral optical density，IOD)比值表示相對表達水平。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 肥胖模型的構建情況

自喂養干預第3周，肥胖模型組小鼠體重增長量開始超出對照組，至第14周末，模型組和對照組小鼠平均體重分別為32.34±1.24 g和23.67±0.96 g，差異具有統計學意義。根據肥胖度計算公式計算模型組每只小鼠的肥胖度：肥胖度(%)=(模型組實際體重-對照組平均體重) /對照組平均體重×100，結果模型組所有小鼠體重均超過對照組小鼠平均體重的20%，其中體重最輕的小鼠肥胖度為28.43%，表明小鼠肥胖模型建立成功。模型組和對照組小鼠各周平均體重(表1)。

表1 不同組小鼠各周平均體重的情況(單位：g)

2.2 十二指腸DMT1、FPN1 mRNA表達水平

十二指腸樣本中提取RNA的A260/A280均在1.9～2.1，說明提取的RNA純度較高。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，圖1可見28S、18S和5S rRNA 3條帶，其中前兩條帶的相對亮度為2∶1，說明RNA完整性好，無明顯降解。

注：A、B、C：對照組樣本，D、E、F：模型組樣本。

實時熒光定量PCR結果，目的基因DMT1、FPN1和內參基因β-actin的標準曲線線性良好，相關系數(R2)均大于0.997，擴增效率在99%～105%之間。融解曲線呈單峰，各基因均為特異性擴增。統計分析顯示，與對照組相比，模型組小鼠DMT1、FPN1mRNA的相對表達水平均降低，差異具有統計學意義(P< 0.05)(圖2)。

注：* 與對照組比較P < 0.05。

2.3 十二指腸FPN1蛋白的表達水平

Western blot檢測結果見圖3所示：模型組小鼠十二指腸FPN1蛋白表達水平低于對照組，其相對表達量分別為0.54±0.13和0.76±0.12，差異具有統計學意義(P< 0.05)。

注：* 與對照組比較P < 0.05。

3 討論

肥胖動物模型是研究肥胖及其相關疾病的主要工具[5]，以與人類肥胖最為接近高脂飼料所致的單純性肥胖模型應用最為廣泛，由于C57BL/6J小鼠對高脂飲食較為敏感，國外很多肥胖相關的研究選用C57BL/6J小鼠進行[6-7]。因此，本研究選擇C57BL/6J小鼠作為研究對象，采用飲食誘導方式建立肥胖模型，模型組小鼠平均體重高于對照組，差異具有統計學意義，證明成功構建肥胖小鼠模型。

腸鐵吸收和釋放主要依賴于腸上皮細胞的鐵吸收蛋白的介導，食物中的三價鐵離子首先被位于十二指腸刷狀緣上的游離還原劑還原成二價鐵離子，然后由位于刷狀緣上的DMT1將其轉運至腸上皮細胞的細胞質內，在上皮細胞內一部分鐵以鐵蛋白的形式儲存在鐵池內，另一部分鐵被亞鐵氧化酶氧化為高鐵后,通過基底膜上的鐵轉運分子FPN1的介導，穿過上皮細胞的基底端細胞膜被運載出細胞,進入循環系統，滿足機體對鐵的需要。機體主要通過控制近端小腸的鐵吸收量和鐵釋放量以達到鐵穩態。肥胖狀態下容易發生鐵代謝紊亂，機體是通過怎樣的途徑如何調節小腸鐵吸收蛋白的表達，腸鐵吸收蛋白如何調節鐵吸收，其具體調節機制目前還不甚清楚。

DMT1僅在哺乳動物小腸上皮細胞高度表達，其最主要的功能是對二價金屬離子的攝取和轉運，是介導膳食中非血紅素鐵從腸腔轉入腸細胞的唯一鐵轉運體[8]。FPN1是一種跨膜的鐵輸出蛋白，主要位于十二指腸上皮細胞的基底部和基底側膜，FPN1是鐵離子釋放的唯一出口，負責將細胞內的鐵轉運出細胞。本次實時熒光定量PCR實驗結果顯示，肥胖小鼠十二指腸上皮細胞的DMT1和FPN1表達水平低于正常小鼠表達水平。肥胖小鼠DMT1表達降低，說明攝入細胞內的鐵量減少，FPN1表達降低，輸出的鐵量則會減少，表明肥胖小鼠轉運鐵的能力下降，肥胖導致小腸上皮細胞攝取及釋放鐵的能力發生障礙。一些利用高脂飼料喂養大鼠建立營養性肥胖模型的實驗也得到了和本研究類似的結論，肥胖可使小腸上皮細胞DMT1mRNA表達降低[9]。許多因素參與DMT1mRNA表達的調控，例如：蛋白激酶C、TNF-α、IFN-γ、炎癥介質、不同的發育階段等。肥胖使小鼠十二指腸DMT1mRNA的表達降低，是肥胖引起上述因素調節DMT1mRNA的表達，還是肥胖狀態直接作用于DMT1mRNA的表達，還需進一步研究。

Frazer等[10]研究發現，細胞基底膜FPN1表達水平僅受機體鐵狀況的影響，而不受腸腔內鐵水平的影響；而DMT1表達水平明顯依賴腸腔內鐵含量的調節，這提示FPN1可能是決定腸鐵吸收水平的關鍵性或限速性鐵轉運分子。目前研究發現，鐵調素是一種肝臟分泌的負性鐵調節因子，其可與FPN1結合，使FPN1內吞、降解，導致細胞內鐵貯留，減少鐵的輸出。鐵調素和FPN1蛋白表達呈負相關。本次Western blot實驗發現，肥胖導致FPN1蛋白表達下降，推測可能與肥胖機體肝臟鐵調素的表達增加有關，鐵調素表達增加造成十二指腸FPN1蛋白表達減少，腸細胞輸出的鐵量降低，進而影響體內鐵水平，這需要進一步的研究，為進一步闡明肥胖影響鐵吸收的分子機制提供理論和實驗基礎。

綜上所述，肥胖導致鐵缺乏主要與負責十二指腸腸鐵吸收的DMT1和FPN1兩種蛋白表達密切相關。肥胖可致使十二指腸DMT1和FPN1表達下降，腸上皮細胞吸收和釋放鐵的能力減弱,造成機體不能滿足對鐵的需求，導致肥胖鐵缺乏的發生。

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