開放翼腭動脈改良制備大鼠自體血栓腦梗死模型比較

周 震，王雪巖，王 坤，王 凱，張玉蓮

(1.天津中醫藥大學第二附屬醫院，天津 300150；2.天津中醫藥大學，天津 300193)

腦梗死又稱缺血性卒中，本病系由各種原因所致的局部腦組織區域血液供應障礙，導致腦組織缺血缺氧性病變壞死，進而產生臨床上對應的神經功能缺失表現，在整個卒中中占很大比例[1]。腦梗死依據發病機制的不同分為腦血栓形成、腦栓塞和腔隙性腦梗死等主要類型。其中腦血栓形成是腦梗死最常見的類型，約占全部腦梗死的60%[2]，因而通常所說的“腦梗死”實際上指的是腦血栓形成，迅速溶栓，恢復血流是最基本、最有效的方法[3]。隨著我國人民生活水平的不斷提高，飲食結構、生活方式和疾病譜逐漸發生變化，青年腦梗死患病率有逐年上升的趨勢[4]，給家庭和社會帶來沉重負擔。為探索血栓性疾病的原因、病理生理變化,開展新療法,預測臨床轉歸，動物模型的建立是不可缺少的手段，近年來，國內外學者通過不同方法建立了多種MCAO模型[5]，本文在Busch[6]，張新江等[7]的實驗方法的基礎上對模型做了進一步改良，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選擇健康SD大鼠33只，為保耐受度與均衡度，全部選用雄鼠，體重200 g左右，SPF級，來源于北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2009-0004】，由中國醫學科學院放射醫學研究所飼養【SYXK(津)2011-0008】，分為三組，其中對照組3只、普通手術組15只，改良手術組15只。實驗中對動物的操作符合《關于善待實驗動物的指導性意見》標準[8]。

1.2 實驗材料

麻藥(10%水合氯醛)，2, 3, 5 -氯化三苯基四氮唑( triphenyl tetrazolium chloride, TTC，Sigma)毛細玻璃管(0.5 mm)，凝血酶，刀片(普通吉列剃須刀片)，手術器材(手術剪一個，彎頭鑷子兩個，縫合針，縫合線)，5.5號靜脈輸液針，動脈夾，載玻片，離心管，碘伏，慶大霉素。

1.3 栓子制備

取健康大鼠一只進行內眥取血0.5 mL，立即注入含有0.75 μL檸檬酸鈉(0.109 mol/L)的EP管內，混勻后5000 r/min離心1 min。取貧血小板血漿160 μL，RBC 10 μL與1單位凝血酶(25萬單位/L)、30 μL氯化鈣(0.5 mol/L)溶液混合，立即將其吸入毛細玻璃管中。為確保血凝的質量，取完血的毛細玻璃管平放，靜置2 min。2 min后，用生理鹽水浸潤后將毛細玻璃管從中間掰斷，并在保持血栓不被拉斷的情況下輕輕至于載玻片上，載玻片上的所有操作要確保在生理鹽水的浸潤下進行。輕輕將所有的血栓全部拉出，最后用刀片將血栓切成1～1.5 mm大小的栓子，放在盛有生理鹽水的培養皿中備用。

1.4 模型制備

注：CCA=頸總動脈，ICA=頸內動脈，MCA=大腦中動脈，PCA=大腦后動脈，ECA=頸外動脈，PPA=翼腭動脈，ACA=大腦前動脈。

改良手術組：采用10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔麻醉后，頸正中切開皮膚，剝離肩胛舌骨肌、胸骨舌骨肌與胸骨乳突肌，暴露頸總動脈(CCA)、頸內動脈(internal carotid artery,ICA)與頸外動脈(ECA)。分離左側ECA與ICA[3-4]。游離ECA遠端并結扎之，凝閉其分支，并再次在ECA下穿過縫合線，備用。用金屬動脈夾暫時夾閉CCA，用5.5號靜脈輸液針逆行穿刺左側ECA至CCA，稍過ICA起始處，然后用穿過備用的縫合線扎緊，隨即用1 mL注射器緩慢推注栓子鹽水懸液直至所用栓子全部進入CCA，撤出輸液針的同時扎緊進針孔。撤去動脈夾后恢復ICA的血供，使栓子通過ICA，在動脈血恢復的瞬間沖擊下進入顱內至大腦中動脈，縫合皮膚。肌注慶大霉素(0.5 mL/只)以抗感染。假手術組手術方法同模型制作，只在注射時以等量生理鹽水代替栓子溶液(見圖1)。

普通手術組：在注入栓子之前結扎翼腭動脈，其余方法同改良手術組。

1.5 模型評價

1.5.1 動物蘇醒后按Bederson評分[9]：無神經損傷癥狀為0分；懸尾實驗不能完全伸展對側前爪為1分；前肢抵抗對側推力能力下降為2分；向對側轉圈為3分。

表1 Bederson評分

表2 梗死灶體積

1.5.2 手術24 h后斷頭取材，完整剝離大鼠全腦，﹣80℃冰凍5 min，至于腦槽上切片后行TTC染色，計算梗死區體積。

1.6 統計方法

2 結果

2.1 Bederson 評分

與對照組比較，兩個手術組評分均明顯升高，說明兩個手術組均出現神經功能損傷，兩個手術組之間比較，沒有表現出明顯差異(P> 0.05)。

2.2 梗死灶的體積

手術24 h后TTC染色見普通手術組與改良手術組均出現白色壞死區域，并且兩組梗死體積相差不大(P> 0.05)，對照組無白色梗死區出現(圖2)。

3 討論

3.1 關于PPA的結扎問題

在以往的實驗研究中實驗者傾向于將同側翼腭動脈(PPA)同時結扎[10]，但是PPA的位置特別深，大約在ICA與ECA分叉上1～1.5 cm處，實驗操作中不容易分離及操作，同時也因為它是ICA的分支，并且直徑遠遠小于ICA，所以本實驗通過控制栓子的大小而不需要結扎來避免栓子通過PPA。通過實際試驗操作及結果來看，不接扎PPA并不影響實驗結果。

3.2 關于不同體重大鼠的選擇問題

大鼠的重量是影響本實驗的一個關鍵因素。在實驗過程中發現，體重過大的大鼠ECA及CCA過于粗壯，栓子不容易造成梗塞，體重過小又不利于針頭穿刺進入CCA進行栓子注入，所以選擇大鼠時控制體重在200 g左右。

3.3 關于栓子的制備問題

栓子的大小要嚴格控制在1～1.5 mm之間，因為太小的栓子不能確保大于PPA的直徑，從而有從PPA通過的可能，太大的栓子不容易從5.5號靜脈輸液針頭通過，容易堵塞針頭而影響注射。其次，將栓子吸入5 mL注射器時應先將針頭拔下再吸入，不可用針頭直接吸入，這樣避免了吸入率低及容易產生氣泡等問題。栓子吸入以后先將輸液針管內注滿生理鹽水然后靠栓子重力緩慢滑至針頭尾端，并且保證每個栓子之間有一定距離從而使它們依次被注入血管。

3.4 關于ECA結扎問題

遠端結扎線盡量靠上，留出足夠的空間進行針尖穿刺；近端結扎線盡量靠近分叉口，可以防止栓子流回ECA。

3.5 關于實驗結果問題

通過最后對大鼠形態的評分比較及TTC染色可以明顯體現兩個手術組與對照組的區別(P< 0.05)，表明實驗結果有意義；并且兩個手術組之間沒有明顯差別(P< 0.05)

3.6 關于本實驗的優缺點問題

本實驗沿用張新江等[11]的栓子制備方法，可造成MCAO的同時而不發生自溶，并且易被溶栓劑溶解。同時由于控制了栓子大小的前提下，開放PPA不接扎，并且在注入栓子的操作中，用普通輸液針頭代替留置針，采用雙線分段結扎，動脈夾單獨夾閉CCA的方法，使得實驗更簡便易行，節省操作時間，降低手術死亡率。

參考文獻：

[1] Yu HL, Zhang ZL, Chen J,etal. Carvacrol, a food-additive, provides neuroprotection focal cerebral ischemia/reperfusion injury in mice [J]. PLoS One, 2012, 7(3): 33584.

[2] 王文化,趙冬,吳桂賢,等. 北京市1984-1999年急性腦出血和腦血栓發病率變化趨勢分析[J]. 中華流行病學雜志, 2002,23 (5):352-355.

[3] 王左生,連亞軍,趙莘瑜,等.腦梗死患者溶栓治療前后經顱多普勒檢測及其臨床意〔J〕.中國危重病急救醫學,2002,11:699.

[4] 杜娟,蔡藝靈,崔永強,等. 青年腦梗死的病因及預后分析[J]. 中國腦血管病雜志,2009,12:626-630.

[5] 陳俊拋,田時雨,于微微,等.多發性腦梗塞癡呆模型的研究.中華神經精神科雜志,1994,27(6):311.

[6] Busch E, Kruger K, Hossmann KA. Improved model of thrombolic stroke and r-tPA induced reperfusion in the rat. Brain Res, 1997,778(1):16.

[7] 張新江,常麗英,張蘇明,等. 大鼠自體血栓大腦中動脈閉塞模型的改良[J]. 卒中與神經疾病,2003,(01):12-15.

[8] The Ministry of Science and Technology of the People’s Republic of China. Guidance Suggestions for the Care and Use of Laboratory Animals. 2006-09-30.

[9] Bederson JB, Pitts LH, Tsuji M,etal. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke. 1986;17(3):472-476.

[10] 李建生,劉敬霞,于海濱,等. 大鼠自體血栓結合線栓阻塞大腦中動脈制備腦缺血模型的建立與評價[J]. 中國危重病急救醫學,2006,(05):272-274.

[11] Vanderschuern S, Vlaenderen IV, Collen D,etal. Intravenousthrombolysis with recombinant staphylokinase versus tissue-typeplasmanogen activation in a rabbit embolic stroke model. Stroke,1997, 28(7):1383.