兔骨性關節炎模型關節軟骨的彌散張量研究

侯 進，梅穎潔，代月黎，許乙凱

(南方醫院影像中心，南方醫科大學，廣州 510515)

骨關節疾病給人類造成的危害愈來愈受到國際醫學界的關注及擔憂，骨關節炎(osteoarthritis, OA)發病率隨年齡增高而增加[1]，OA是一個以關節軟骨退行性改變為核心，累及骨質并包括滑膜，關節囊及關節其它結構的全方位，多層次，不同程度的關節疾病[2]。隨著磁共振技術的發展，磁共振功能新的成像技術已廣泛地應用于骨性關節炎軟骨損傷早期評價的研究，磁共振擴散張量成像(diffusion tensor imaging，DTI)可定量分析水分子在不同方向上擴散的各向異性，從而觀察組織的細微結構,無創性地提供常規磁共振不能提供的人體組織微觀結構。它不僅能獲取ADC值，而且更能獲取反映水分子擴散各向異性數值(fractional anisotropy，FA)，反應透明軟骨膠原纖維微細結構變化, 研究顯示ADC值和FA值對診斷早期軟骨損傷均有較高的特異性和敏感性[3]。但關節軟骨尤其是對OA關節軟骨的DTI研究不多，需要更多的實驗進一步探討。

1 材料和方法

1.1 動物模型建立和處理

選用成年新西蘭大白兔24只，合格證號為[SCXK(粵)2011-0015]，將其隨機分成為A、B、C、D四組，其中A、B、C三組為處理組，采用膝關節備皮、予75%乙醇消毒后，屈曲45°以髕腱外緣、平髕骨下極處為進針點，向髁間窩方向進針，抵達股骨髁后回撤2 mm，注入0.3 mL體積分數2%木瓜蛋白酶水溶液[4]。A組(一次注藥組)于模型制作完成后24 h內行MR檢查；B、C組于實驗的1、4、7 d分三次注藥制作模型，B組于最后一次注藥完成后24 h內行MRI檢查，C組于最后一次注藥后一個月行MRI檢查； D組作為空白組。A、B、C組檢查結束后將兔麻醉后處死，D組作為空白組分別在與A、B、C組掃描結束后隨機取出兩只麻醉后處死，將處死后兔的雙膝關節取下，10%甲醛浸泡，待病理檢查。

1.2 磁共振成像方法

A組在第一次注藥后24 h內、B組在第三次注藥后24 h內、C組在第三次注藥后一個月進行掃描，A、B、C組掃描的同時對同期D組進行磁共振成像。采用荷蘭Philips公司生產的Achieva 3.0T超導型MR掃描儀、專用動物線圈，行膝關節常規掃描，T1WI、T2WI和PDWI(加脂肪抑制)，再行DTI掃描分別測量關節軟骨FA和ADC值。掃描參數：DTI采用EPI序列，總掃描時間：07 min 55 s，FOV=120(RH)×120(AP)×24(FH)，TR=1000 ms，TE=56ms，層厚=2 mm，像素 1.2 mm×1.2 mm，NSA=4,翻轉角=90。PDW 采用TSE序列：FOV=80 mm×80 mm×36 mm，TR=2013 ms，TE=20 ms，層厚=2.5 mm，像素=0.40 mm×52 mm。

掃描完成后將動物處死取膝關節軟骨行HE染色與檢測蛋白多糖含量的阿爾新蘭染色(彩插5圖1)。

1.3 圖像后處理

采用ImageJ后處理軟件，在橫軸位質子相圖像上，手動繪制感興趣區，盡可能包括整個髕軟骨面(彩插5圖2)，在對應的DTI圖像上測定平均的ADC和FA值。

1.4 統計學分析

使用SPSS 13．0軟件包，采方差分析對各組處理組、對照組之間在不同時間點軟骨的FA、ADC值變化進行分析；P< 0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FA值各組間均有顯著差異；ADC值正常對照組與中期模型組無明顯差異，余各組間有顯著差異。

2.2 隨著退變程度的加重，FA值減低越明顯, 早期ADC值先增高后降低(彩插5圖3，表1)

表1 各模型組與正常組的ADC、FA值比較

3 討論

3.1 動物模型的選擇和建立

骨關節炎是因多種致病因素所導致的以關節軟骨退變為主要病理特征的一組臨床綜合癥，目前用于OA模型復制的動物有很多，但其病理變化機制及病變進展速度有很大區別，如何選擇一個合適的動物模型，對研究來講是成功的關鍵[5-6]。鼠模型關節軟骨退變的組織學特征與人類OA相似，基本能滿足要求，但對于這種較小動物的關節來講，關節腔反復注射的創傷對實驗影響較大；猴子具有與人類最相似的結構，但獲之不易，價格高，研究跨度大；犬、羊等大型動物關節較大，較易操作造模，可供實驗用材料豐富，但操作也并不簡單，經費不足也難以考慮。兔膝關節組織結構與人類接近，可研究材料豐富，其模型的軟骨生化指標與人類OA非常接近，兔性情溫和，手術操作較簡單，易于飼養和關節內注射，關節體積較大，可供研究的材料又遠多于其他動物，便于進行比較研究。

3.2 兔膝關節OA模型的病理及MRI分級

根據膠原纖維的排列方式不同，關節軟骨在組織形態學上從表層至深層可分為四層[7]：①表層，構成關節軟骨的最外層，由平行于關節面致密排列的薄層膠原纖維組成，蛋白聚糖(proteoglycans，PGs)在此層含量最低；②中間層，緊鄰表層，膠原纖維隨意向四周散開斜行排列，進入軟骨表層；③深層：含有最豐富的PGs和膠原纖維，含水量很少，膠原纖維多呈垂直狀排列，與鈣化帶間有一被稱為“潮標”的清楚分界；④鈣化層，含豐富的羥基磷灰石鹽，細胞極少。

兔膝關節關節腔內重復注射木瓜蛋白酶溶液可快速破壞、分解軟骨基質，降解蛋白多糖。早期骨性關節炎模型組蛋白多糖減少，表層膠原纖維結構改變，主要表現為Ⅱ型膠原含量基本不變，Ⅱ型膠原纖維的腫脹、膠原網的破壞；HE染色軟骨表面欠光整，可見簇集的軟骨細胞，Mankin評分2～5，MRI示關節軟骨邊緣毛糙。中期模型組軟骨表層及中間層膠原纖維中斷、纖維化，軟骨細胞及蛋白多糖進一步減少；HE染色軟骨表層可見裂隙及纖維化改變，軟骨細胞排列紊亂，軟骨潮線不規則，Mankin評分8～9，MRI軟骨信號不均勻，邊緣模糊。晚期模型組軟骨破壞進一步加重，軟骨缺損可達深層，累及潮線，可見大范圍的纖維化改變，軟骨細胞及蛋白多糖明顯減少，HE染色軟骨纖維化可達深層，軟骨細胞明顯減少，潮線基本消失，鈣化層難以分辨， Mankin評分9～11；磁共振示軟骨信號不均，軟骨面變薄、中斷，關節腔明顯積液。DTI FA偽彩圖可顯示纖維的位置與走行(彩插5圖3)。

對照組HE染色表層光滑、平整，軟骨細胞層次清楚，無簇集，潮線完整，Mankin評分0～1，膝關節矢狀位質子相可見關節軟骨面光整、厚度均勻。

阿利新蘭檢測存在于軟骨細胞周圍的酸性粘多糖(硫酸軟骨素)，酸性粘多糖呈藍色。而骨性關節炎病變首先表現為軟骨基質的降解破壞與關節破壞區各種粘多糖減少, 特別是酸性粘多糖減少，藍色基質淡染。處理組行股骨、脛骨及髕骨阿爾新蘭染色顯示軟骨周圍的酸性粘多糖較對照組變淺，表明軟骨基質較對照組減少。

鑒于兔膝關節橫軸位DTI圖像上髕骨顯示清晰，另一方面，木瓜蛋白酶誘導骨性關節炎模型三部位軟骨阿爾新蘭及HE染色結果一致，故設髕軟骨為測量的感興趣區域。

3.3 兔膝關節OA模型的DTI實驗結果分析

水分子的彌散運動表現分為各向同性彌散與各向異性彌散。高彌散區域具有高ADC值，低ADC值表示水分子彌散能力低。本研究結果發現，不同分組之間ADC值有統計學差別，且ADC在早期升高較為明顯，隨著退變程度的加重，ADC值逐漸減低。我們推測此結果與軟骨的生化改變有關。關節退變中基質組分的一種改變就是蛋白多糖的減少，其與ADC值的變化關系密切[8]，這與蛋白多糖對水分子的作用有關。正常軟骨中蛋白多糖通過自身的負電荷結合水分子，從而維持其生物力學特性。在軟骨病變早期，由于膠原纖維的結構發生改變和破壞，蛋白多糖減少及蛋白多糖的降解引起結合水的釋放，導致軟骨組織中結合水減少而關節間隙內的自由水增加；此外，Ⅱ型膠原的退變增加了關節表面的摩擦和對水的通透性，關節液可滲入軟骨內，因此，早期退變關節軟骨ADC值升高明顯。骨性關節炎中晚期軟骨變薄，出現纖維化，蛋白多糖大量流失，負電荷的減少直接導致軟骨水分的減少，所以在骨性關節炎中晚期軟骨ADC值逐漸減低。

FA值為定量分析各向異性最常用參數，反映水分子彌散的各向異性成分與各相同性成分的比值，自由水腦脊液的FA值為0。本兔子模型研究中，早期骨性關節炎退變主要是結構的改變，Ⅱ型膠原含量基本不變，Ⅱ型膠原纖維的腫脹、膠原網的破壞，減弱了對蛋白多糖的限制，導致自由水的增加，FA值減低[9-10]；另外，電鏡觀察發現，隨著骨關節炎的進展，膠原纖維走向方向異常，增粗的Ⅱ型膠原纖維中出現了Ⅰ型膠原纖維，這兩方面都將導致骨性關節炎中晚期FA值的降低。

FA值反映水分子彌散方向及反應組織結構的關系，提示FA值聯合ADC值診斷軟骨退變更為客觀而準確[11]。

3.4 本實驗的不足和局限性

由于目前DTI的低空間分辨率，實驗所得到的圖像質量不高，隨著技術和硬件的改進，這方面的不足有望克服。本實驗的樣本數較少，因此本結果需要更大樣本量的研究進一步驗證。

DTI能夠有效的反映軟骨組織成分改變，可以無創性量化評估軟骨早期損傷，在軟骨修復術后評估中也可能會具有重要臨床應用價值。

參考文獻：

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