結核病生物診斷試劑豚鼠模型建立

龔寶勇，吳玉娥，黃姣艷，崔玉華，張 鈺

(1. 廣東省實驗動物監測所，廣州 510663；2. 廣東省實驗動物重點實驗室，廣州，510663；3. 廣東瀚森生物藥業有限公司，東莞 523808)

結核病是由結核分枝桿菌引起的人畜共患慢性傳染病，在世界范圍內具有高致病性和致死性。有關結核病的各項研究已成為全球學者關注的熱點，特別是結核病生物診斷試劑的研究和開發[1]。結核病生物診斷試劑的上市和臨床應用必須經過動物模型評價，因此建立合適的結核病生物診斷試劑模型，可避免人體試驗的風險，還可嚴格控制實驗條件，增強實驗材料可比性和重復性，有利于更全面認識生物診斷試劑的有效性和安全性[2]。豚鼠對結核分枝桿菌高度敏感，遲發型超敏反應非常強烈，已經被廣泛應用于抗結核藥物和相關生物制劑檢測中，成為人類結核菌素皮膚試驗效能和結核檢測生物制品鑒定效價的金標準[3-5]，而且根據《中國藥典》2010版第三部，必須應用致敏豚鼠來評價體內診斷類結核病生物診斷試劑[7]。本研究旨在探索不同滅活H37Rv全菌體致敏劑量和致敏次數及皮試次數對模型結果的影響，為建立更簡單、安全、可靠的結核病生物診斷試劑模型提供參考。

1 材料和方法

1.1 注射菌液制備

H37Rv菌株用Middlebrook 7H11培養基培養21 d，收集菌體，PBS洗3次，115℃，10 l b滅活30 min，干燥，放于4℃冰箱備用。稱取滅活H37Rv全菌體，加入注射用生理鹽水和等量弗氏不完全佐劑，研磨均勻乳化至滴入清水不散開。共配成3個劑量組：0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.5 mg/mL，現配現用。

1.2 實驗動物

SPF級Hartley豚鼠，雌雄各半，35～45日齡，廣東省醫學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(粵)2008-0002。動物飼養于屏障動物實驗室，實驗動物使用許可證編號：SYXK(粵)2012-0122，飼養管理嚴格按照《實驗動物飼養管理和使用指南》進行。

1.3 致敏和皮試

致敏劑量評估：豚鼠檢疫適應7 d后，分為3組(0.2 mg/mL劑量組、0.3 mg/mL劑量組、0.5 mg/mL劑量組)，每組44只，雌雄各半，每只豚鼠大腿內側腹股溝皮下注射相應劑量滅活H37Rv全菌體0.5 mL，分3個位點進行注射。致敏后第5周背部剃毛，皮內注射0.1 mL(5IU)標準結核菌素(TB-PPD)進行皮試。皮試后24 h、48 h各觀察豚鼠1次，測量、記錄皮試紅斑硬結的縱橫徑值，對各組結果進行統計分析。

致敏次數評估：選擇8只豚鼠，雌雄各半，接種0.5 mg/mL滅活H37Rv全菌體致敏，每次0.5 mL，每周1次，持續3周。首次致敏后第5周背部剃毛，皮內注射0.1 mL(5 IU)標準結核菌素(TB-PPD)進行皮試。皮試后24 h、48 h各觀察豚鼠1次，測量、記錄皮試紅斑縱橫徑值并計算統計其均值，與致敏劑量為0.5 mg/mL致敏1次的豚鼠進行比較。

皮試時間評估：選擇8只豚鼠，雌雄各半，0.3 mg/mL滅活H37Rv全菌體致敏，致敏后第5、7、9、11周背部剃毛，皮內注射0.1 mL(5IU)標準結核菌素(TB-PPD)重復進行皮試。比較不同皮試時間紅斑的縱橫徑值。

1.4 觀察指標

致敏后每周1次稱量豚鼠體重，連續5周，制作體重生長曲線；致敏后每周觀察豚鼠腹股溝皮下注射部位潰爛情況，連續5周。皮試后24 h、48 h各觀察豚鼠1次，測量、記錄皮試紅斑的縱橫徑值并計算統計其均值。

1.5 判定依據

根據《中國藥典》2010版第三部，致敏豚鼠應用標準結核菌素(TB-PPD)皮試后24 h紅斑縱橫徑值應大于5 mm，才能用于評價體內診斷類結核病生物診斷試劑[7]。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 致敏豚鼠體重變化情況

不同劑量滅活H37Rv全菌體致敏豚鼠后，動物飲食、飲水正常，體重持續增加。在致敏后第5周，0.2 mg/mL劑量組、0.3 mg/mL劑量組和0.5 mg/mL劑量組平均體重分別為：(478.7±38.5)g、(493.0±53.0)g和(490.6±43.5)g，與初始平均體重比較，體重分別增加了158.6 g、142.1 g和195.7 g。結果見圖1。

圖1 不同劑量滅活H37Rv全菌體致敏后豚鼠體重曲線

2.2 不同劑量致敏豚鼠后注射部位變化

豚鼠注射0.5 mg/mL滅活H37Rv全菌體致敏后，注射部位出現硬節和潰爛。潰爛出現的時間在致敏后第4周，有18.9%的豚鼠發生潰爛，第5周有33.3%的豚鼠發生潰爛，在整個實驗周期內潰爛不會愈合。見圖2。

2.3 不同劑量滅活H37Rv全菌體致敏豚鼠后紅斑縱橫徑值比較

皮試后24 h，0.3 mg/mL組和0.5 mg/mL組皮膚紅斑縱橫徑平均值均小于0.2 mg/mL組(15.4±2.3)mm，三組比較，差異有顯著性(P≤0.05)。皮試后48 h，3個劑量組皮膚紅斑縱橫徑值比較，差異無顯著性(P≥0.05)。結果見表1。

2.4 多次致敏和單次致敏皮膚紅斑縱橫徑值比較

實驗結果顯示，采用0.5 mg/mL 致敏劑量連續三次致敏豚鼠，皮試后24 h和48 h紅斑縱橫徑均值與單次致敏豚鼠的紅斑縱橫徑均值相比較無顯著性差異(P>0.05)。結果見表2。

2.5 不同皮試次數紅斑縱橫徑值比較

實驗結果顯示，采用0.3 mg/mL滅活H37Rv全菌體致敏豚鼠，第1次皮試后24 h紅斑縱橫徑值大于第2次、第3次和第4次皮試后紅斑縱橫徑值，各組間比較有統計學差異(P≤0.05)；皮試后48h測量發現第2次皮試后紅斑縱橫徑值顯著低于其它3次皮試后紅斑縱橫徑值( (P≤0.05)，結果見表3。

表1 滅活H37Rv全菌體不同致敏劑量皮試紅斑縱橫徑值比較

表2 0.5 mg/mL滅活H37Rv全菌體3次致敏與單次致敏豚鼠皮試紅斑縱橫徑值比較

表3 0.3 mg/mL滅活H37Rv全菌體致敏后不同皮試次數后紅斑縱橫徑值的變化

3 討論

自從結核菌素反應被羅伯特·科克在一個世紀前發現以來，豚鼠就成為研究遲發型致敏反應(DTH)的動物模型，且其DTH反應與人類進行的TB-PPD皮試反應非常相似[6]。根據《中國藥典》2010版第三部，必須應用豚鼠來評價體內診斷類結核病生物診斷試劑[7]。

我們的研究結果顯示，采用0.2 mg/mL H37Rv滅活全菌體單次致敏豚鼠，24 h和48 h皮試紅斑縱橫徑均值分別為15.4±2.3 mm和11.0±2.2 mm，達到《中國藥典》2010版第三部規定的“致敏豚鼠皮試后24 h紅斑縱橫徑值應大于5 mm”的判定要求。張靈霞等[11]采用0.1 mL (5 mg)滅活H37Rv全菌體連續4次致敏豚鼠，皮試后24 h和48 h紅斑縱橫徑均值分別為(8.25±1.73)mm和(7.41±1.22)mm，小于我們的致敏結果。我們分析此模型皮試反應強度較弱可能與其未使用弗氏不完全佐劑有關。Suely S. Kashino等[8]應用18b結核分支桿菌活菌制備豚鼠模型比應用滅活H37Rv全菌體致敏豚鼠模型DTH反應更強烈，24 h DTH皮試反應紅斑縱橫徑值為(18±3)mm，但會引起動物消瘦甚至死亡。根據我們的研究結果和已知文獻[8,11]，我們發現豚鼠DTH皮試反應的強度與結核分支桿菌是否滅活有關，與致敏次數無關，多次致敏不能達到增加變態反應強度的效果。當致敏劑量達到可引起明顯DTH皮試反應的情況下，增加致敏劑量對皮試結果無顯著影響，反而可能會引起接種部位的嚴重潰爛。

人類感染結核桿菌后，會引起嗜睡、精神萎靡、體重減輕直至死亡等[9]，本研究應用滅活H37Rv全菌體致敏豚鼠，豚鼠體重持續增長，未觀察到豚鼠有明顯不適反應。注射部分出現潰爛主要是弗氏不完全佐劑引起的不良反應[10]，采用多點注射可以適當降低潰爛的發生率。

總之，本研究完善了結核病生物診斷試劑模型建立，改進了制備滅活H37Rv全菌體致敏豚鼠模型的方法。與國內外文獻記載的其他結核病生物診斷模型制備方法相比，本研究采用0.2 mg/mL H37Rv滅活全菌體單次致敏豚鼠，可引起適當的變態反應(達到標準要求)且不會引起動物死亡，是比較合適的致敏劑量，可廣泛應用于結核病生物診斷試劑的研制和評價。

參考文獻：

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[11] 張靈霞, 吳雪瓊, 史迎昌, 等. 幾種結核分支桿菌重組蛋白誘發豚鼠遲發型超敏反應的研究[J]. 中國防癆雜志， 2002, 24:116-118.