整合CAMVA和BCOP方法檢測化妝品的眼刺激性

秦 瑤，程樹軍，黃健聰，黃 玲，陳 彧

(1. 廣東出入境檢驗檢疫技術中心,廣州 510623; 2. 新疆出入境檢驗檢疫局技術中心，烏魯木齊 830063)

歐盟化妝品動物實驗禁令的發布和實施，為檢測機構在產品安全性評價中建立科學合理的體外替代方法提出了要求。既然化妝品眼刺激評價的Draize兔眼試驗已被法規禁止，那么在多種有效的體外方法中選擇建立整合應用策略是比較理想的模式，這些方法包括離體雞眼試驗(ICE)、雞胚絨毛膜尿囊膜試驗(HET-CAM、CAMVA、CAMTB)、牛角膜渾濁及通透度試驗(BCOP)、短時間暴露試驗(STE)、熒光素漏出試驗(FL)等[1-3]。本實驗研究組合兩種有效的眼刺激體外方法——雞胚絨毛膜尿囊膜血管試驗(CAMVA)和BCOP試驗，對60種個人護理產品眼刺激性進行評價，并與動物實驗進行比對，建立CAMVA-BCOP組合策略，為個人護理用品的眼刺激性的體外評價提供數據支持。

1 材料和方法

1.1 樣品

市售化妝品合計60種，分為3類，清潔沐浴類產品(沐浴露、洗發水、清潔液等)22種，眼部用產品(粉底、眼線、眼霜、睫毛膏、眉筆等)17種和護膚類產品(防曬霜、防皺霜、祛斑、植物精油等)21種。

1.2 主要材料、試劑及儀器

SPF級白萊杭雞受精雞胚(購于新興大華農禽蛋有限公司，實驗動物生產許可證：SCXK(粵)2008-0019，牛眼球取自廣州地區屠宰場，普通級實驗兔購自廣東省醫學實驗動物中心(實驗動物生產許可證：SCXK(粵)2008-0002。含酚紅及不含酚紅MEN培養基(含1% FBS和L-谷氨酰胺)、HBSS、熒光素鈉均購自Sigma公司，含Ca2+、Mg2+的DPBS，10%氫氧化鈉(廣州化學試劑廠)，“O”形特富龍環(孔徑0.8 mm)，角膜濁度儀(德國BASF-OP3.0)，全波長酶標儀(美國Thermo)，培養箱(德國Memmert)等。

1.3 CAMVA方法及眼刺激性分類

將1 d齡雞胚置于培養箱37℃孵育，于第4天在雞胚窄端鉆一小孔，抽取約3 mL蛋清后用火膠棉封住小孔。在雞胚位置的上方開約5 mm×10 mm的矩形小窗并移除蛋殼，暴露雞胚，以保鮮膜覆蓋。隨后放回培養箱繼續孵育。第14天，取出雞胚，擴大觀察窗，于絨毛尿囊膜上放置“O”形特富龍環，取40 μL(固體40 mg)不同濃度受試物加入環內，37℃孵育。30 min后，觀察血管變化，計數陽性反應(出現溶血、血管消失、血管凝固等)雞胚個數，最后計算RC50，即引起一半雞胚出現陽性反應的受試物濃度。如果樣品RC50>3%，判定為無刺激性，≤3%，則為有刺激性[4]。

1.4 BCOP方法及眼刺激性分類

參考OECD指南437，取新鮮牛眼球切取角膜，將其裝配于專用支架中。前后室均填滿無酚紅MEM，于(32±1)℃培養箱平衡1 h后用濁度儀讀數角膜濁度本底值。移除前室培養基后加入750 μL未稀釋液體受試物(固體為20%懸液)，孵育10 min(固體為4 h)，用含酚紅MEM沖洗至樣品無殘留。前室重新填滿無酚紅MEM后返回培養箱孵育2 h(固體無需后孵育)后讀取終末濁度值。去除前室培養基，加入1 mL 0.4%(固體為0.5%)由含Ca2+、Mg2+DPBS配制的熒光素鈉溶液，孵育90 min。收集后室全部液體，混勻后取360 μL在490 nm波長下讀取吸光度值。根據公式計算體外刺激評分值(in vitro irritancy score, IVIS)：IVIS=濁度值 + 15 × 吸光度。每個樣品重復3個角膜。IVIS≤3，預測無刺激性，3～55預測刺激性(包括2A和2B類)，>55預測嚴重刺激性[5]。

1.5 Draize兔眼試驗

成年健康家兔，在其中一只眼睛結膜囊滴入0.1 mL受試物，另一只眼睛作為對照，于染毒后24 h、48 h、72 h、4 d、7 d觀察眼睛結膜、角膜、虹膜反應。根據改良最大平均得分MMAS (modified maximum average score)進行分類：MMAS≤2.5為無刺激性， 2.5～25為輕刺激性，25～50為中度刺激性，>50為嚴重刺激性/腐蝕性。

1.6 統計學方法

比較不同方法結果對物質分類是否具有一致性，采用Kappa一致性檢驗 (Kappa≥0.75一致性好；0.75

2 結果

60種產品的體外測試和動物測試結果見表1。經Draize試驗的樣品，結果為42種無刺激性，11種微弱刺激性、5種中等刺激性和2種嚴重刺激性。CAMVA試驗結果為41種無刺激性，19種為有刺激性；BCOP試驗結果為35種無刺激性，21種輕-中刺激性，4種嚴重刺激性。

以體內實驗為判斷標準，參考替代方法驗證的準則[2]。CAMVA方法可以區分41種無刺激性樣品，特異性為97.6%(41/42)，可區分全部18種有刺激性的樣品，敏感性為100%(18/18)，但對刺激程度的預測效果不理想，總的分類一致性達到98.3%(59/60)，Kappa=0.890。陽性預測性為94.7%(18/19)，陰性預測率為100%(41/41)，假陽性率為2.4%(1/42)，假陰性率為0%(0/18)。

BCOP方法對于陽性結果的預測，總敏感性為100%(18/18)，其中嚴重/腐蝕性刺激性預測，敏感性為100%(2/2)，對于中度-輕度刺激性的區分，敏感性為95.8%(14/16)。BCOP可以區分35種無刺激性樣品，特異性為83.3%(35/42)。總的分類一致性達到85%(51/60)，其中陽性預測性(含輕度,中度和嚴重刺激性)為72%(18/25)，陰性預測性為100%(35/35)。假陽性率為20.0%(7/35)，假陰性率為0%(0/18)。分類不一致的情況是將1種輕度和1種中度刺激性誤分類為嚴重刺激性，7種無刺激性誤分類為輕-中度刺激嚴重刺激性。

試驗結果表明，CAMVA區分了41種無刺激性樣品，18種有刺激性樣品，與兔眼試驗一致性達到98.3%(59/60)，但對于有刺激性樣品并無確切的程度對應區分。BCOP鑒別了35種無刺激性樣品和25種有刺激性樣品，總的分類一致性為85%，一致性檢測Kappa=0.743，低于CAMVA法，主是原因是BCOP方法將較多的無刺激類歸為不可預測類。采用CAMVA-BCOP的組合方法(表2)：對于陽性結果的預測總敏感性為100%(18/18)，其中嚴重刺激性預測敏感性為100%(2/2)，對于中度-輕度刺激性的區分，敏感性為100%(15/15)，對于無刺激性樣品預測的特異性為97.6%(41/42)。總的分類一致性達到98.3%(59/60)，其中陽性預測性為100%(18/18)，陰性預測性為100%(35/35)。假陽性率為2.4%(1/42)，假陰性率為0%(0/18)。

表1 體內和體外實驗結果

表2 組合方法實驗結果

圖1 組合CAMVA-BCOP方法的眼刺激試驗策略

3 討論

傳統Draize兔眼試驗存在評分主觀性、重復性差、耗時、方法殘忍等不足，無法滿足產品精確定量評價的要求。近20多年來，已開發了多種體外方法用于替代兔眼試驗，不僅可以減少體內試驗的不足，而且遵循了動物實驗減少優化和替代的3R原則。但是，鑒于體內眼刺激反應尚包括眼瞼、結膜和角膜的反應，僅使用單一體外方法無法完全模擬體內反應，不同方法適用范圍也存在差異，體外方法還不能很好地檢測損傷后的修復作用。因此考慮組合兩個或兩個以上體外方法建立整合測試策略，以覆蓋眼刺激性反應累及的范圍和程度。

雞胚絨毛膜毛尿囊膜結構與眼結膜相似，CAMVA方法通過觀察受試物對血管的作用評價潛在的眼刺激性，具有較高的敏感性[6]。對于檢測中度以下的眼刺激性效果較好，尤其是能有效區分無刺激性物質[7]，但對輕度刺激性以上的物質無法精確區分。其不足之處還表現在對含聚氧乙烯配方的檢測中容易導致假陽性結果[6]，實驗持續時間較長，對不溶物質的操作要求較高等。該方法適合作為化妝品和個人護理用品配方、醇類物質和表面活性劑的刺激性篩查[2,5]。

BCOP以離體牛眼角膜模擬人角膜進行受試物暴露，通過測量角膜渾濁度及滲透性的改變評價受試物眼物刺激性[8]。其優點在于不受樣品理化性質和溶解性的限制，可用于化學品眼刺激標識和分類，還可以延長角膜培養時間和增加角膜組織學檢查以評估刺激損傷后的恢復作用和機制分析。缺點是只評估了角膜損傷，沒有考慮受試物對虹膜和結膜的刺激作用[9]。BCOP法于2009年被OECD認可發布為試驗指南(TG 437)，用于嚴重刺激性和腐蝕性的鑒別，2013年重復修訂的版本，確定了其在鑒別無刺激性中的作用[4]。

本研究結果表明，采用CAMVA-BCOP的組合方法可明顯提高眼刺激性預測的一致性和敏感性，彌補單一方法的不足，達到替代體內實驗的目的。如果了解產品成分或配方結構，替代方法的組合應用特別具有優勢。如何選擇方法組合及其順序應綜合考慮評估目的和樣品特性等因素，例如美國EPA推薦采用BCOP法、細胞傳感器法和重建角膜模型(EpiOcular)的組合策略，用于抗菌劑眼刺激性的檢測[3]。Donahue等人建立了基于化妝品配方優化的CAMVA和BCOP的組合方法[10]。日本學者建立了STE與BCOP方法的組合評價化合物的眼刺激性[11]。本研究建立CAMVA-BCOP整合方案適用于個人護理用品的測試，主要考慮到大部分樣品眼刺激性較溫和，而且劑型多樣，配方多變的特點，實驗順序采用先CAMVA后BCOP的組合。如果是工業化學品，關注的是化學物刺激性的準確標識和分類，眼刺激性波動范圍可能較大，可在預判的基礎上，選擇BCOP單一方法測試或選擇先BCOP后CAMVA的組合[12]。根據新版的OECD指南，BCOP可以有效鑒別刺激譜兩端的樣品，配合敏感性高的CAMVA，這一組合可解決大部分樣品眼刺激性檢測的需要，建議的測試程序如圖1。相信隨著更多標準化的眼刺激替代方法的研發，以及針對不同測試目的建立組合方案的探索和驗證，有希望進一步提高眼刺激性預測的科學性。

參考文獻：

[1] 敖華英, 程樹軍, 談偉君. 不同哺乳動物紅細胞溶血替代眼刺激實驗的比較 [J]. 中國組織工程研究, 2012, 16(12):2163-2166.

[2] 程樹軍, 焦紅. 實驗動物替代方法原理與應用 [M]. 北京: 科學出版社. 2010:285-304.

[3] EPA BRD-Final Report. Background review document of an in vitro approach for EPA toxicity labeling of anti-microbial cleaning products: EPA toxicity labeling background review document [R]. USA: EPA, 2009.

[4] Bagley DM, Waters D, Kong BM. Development of a 10-day chorioallantoic membrane vascular assay as an alternative to the Draize rabbit eye irritation test [J]. Food Chem Toxicol, 1994, 32(12):1155-1160.

[5] OECD. OECD guideline for testing of chemicals No. 437: Bovine corneal opacity and permeability test method for identifying i) Chemicals inducing serious eye damage and ii) Chemicals not requiring classification for eye irritation or serious eye damage [S]. OECD Paris, 2013, 1-27

[6] Bagley DM, Cerven D, Harbell J. Assessment of the chorioallantoic membrane vascular assay (CAMVA) in the COLIPA in vitro eye irritation validation study [J]. Toxicol In Vitro, 1999, 13(2):285-293.

[7] Daniel MB, Perveen YR, Betty MK, et al. Evaluation of the vascular components of the chorioallantoic membrane assay as a model for eye irritation potential: II [J]. Cutan Ocular Toxicol, 1991, 10(1-2):105-113.

[8] Cameron DM, Donahue DA, Costion GE, et al. Confirmation of in vitro and clinical safety assessment of behentrimonium chloride-containing leave-on body lotions using post-marketing adverse event data[J]. Toxicol In Vitro, 2013,27(8):2203-2212.

[9] ICCVAM. Test Method Evaluation Repor: In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM)[R]. NIH Publication : 2007.

[10] Donahue DA, Kaufman LE, Avalos J, et al. Survey of ocular irritation predictive capacity using chorioallantoic membrane vascular assay (CAMVA) and bovine corneal opacity and permeability (BCOP) test historical data for 319 personal care products over fourteen years [J]. Toxicol In Vitro, 2011, 25(2):563-572.

[11] Hayashi K, Mori T, Abo T, et al. A tiered approach combining the short time exposure (STE) test and the bovine corneal opacity and permeability (BCOP) assay for predicting eye irritation potential of chemicals[J] Toxicol Sci. 2012, 37(2):269-280.

[12] 敖華英,程樹軍,潘芳,等.化妝品眼刺激試驗替代方法標準化與展望[J],中國比較醫學雜志,2012,22(1):79-83.