利用超數排卵技術進行優化C57BL/6J小鼠的生物凈化體系

馮 穎，王芊芊，陸文昊，曹敏梁

(1. 浙江大學實驗動物中心， 杭州，浙江 310058；2. 臺州醫院生殖中心，臺州，浙江 317000)

C57BL/6J近交系小鼠以其特有的生理學特性，被廣泛用于制作轉基因小鼠。在轉基因小鼠制備、飼養及品系共享等過程中，容易造成病原微生物的感染。這些病原體不僅對實驗結果產生干擾，對人類的健康也產生極大的威脅。因此，擁有標準化的SPF級實驗小鼠是相關研究的基礎，而感染小鼠通過生物凈化方法達到SPF級標準是目前唯一有效的技術手段，生物凈化方法主要包括剖宮取胎和胚胎移植。剖宮取胎操作相對簡單，但存在凈化不徹底和難以計算最佳剖宮時間等弊端；而胚胎移植則需要掌握扎實的胚胎移植技術。本實驗以C57BL/6J野生型雌鼠為實驗對象，對其注射不同劑量的孕馬血清促性腺激素(PMSG)和人絨毛膜促進腺激素(hCG) 進行超數排卵后，與剖宮取胎和胚胎移植兩種方法相結合，通過比較分析平均卵母細胞數、平均胚胎數、受精率、見栓率、胚胎移植成活率，為生物凈化提供優化方案。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及實驗環境

4周齡SPF級C57BL/6J雌鼠108只，18～22 g，均來源于上海斯萊克實驗動物有限公司 [SCXK(滬)2007-0005]，按照SFP級標準飼養于浙大實驗動物中心屏障系統，自由飲水，室溫(20±2)℃，光照12 h/d，(8∶00～20∶00)，經過1周的適應性飼養。

1.2 儀器與試劑

超凈工作臺，CO2恒溫培養箱( Thermo )，體式解剖鏡(Olympus SZ61 )，養皿 ( 35 mm，60 mm，Corning )，酒精燈，相差顯微鏡(Nikon SM2645)，鑷子，口吸式移卵管；注射用血促性素(PMSG)、注射用絨促性素(HCG)購自寧波市三生藥業有限公司，其余試劑均為Sigma公司產品。

1.3 動物實驗

1.3.1 試驗分組：5周齡的C57BL/6J雌鼠108只，根據剖宮取胎、體外和體內胚胎移植三種方法分為三個試驗，每個試驗四個劑量組，每組各12只，重復3次。

1.3.2 小鼠超排：下午4點，四組分別腹腔注射5 IU、7.5 IU、10 IU、15 IU的PMSG，48 h后分別注射相同劑量的HCG。試驗一：四組雌鼠注射HCG后，與同系性成熟雄鼠合籠，次日驗陰栓并記錄，18 d后進行剖宮取胎進行統計；試驗二：四組雌鼠注射HCG 15 h后，收集卵母細胞，進行體外受精及2-細胞胚胎移植；試驗三：四組雌鼠注射HCG后，與同系性成熟雄鼠合籠，次日驗陰栓并記錄，1.5 d后獲取體內2-細胞胚胎并進行移植。

1.3.3 培養基準備：采卵前1 d，用直徑35 mm 培養皿做HTF培養滴，石蠟油覆蓋，放入37℃，含5% CO2培養箱中培養12 h。

1.3.4 精子采集：取交配過的性成熟C57BL /6J雄鼠1只，頸椎脫臼處死，剪下附睪的上體部，用注射針刺破，擠出精子團放入HTF培養滴中，CO2培養箱中放置1 h 再行體外受精。

1.3.5 卵母細胞的收集：用頸椎脫臼法處死小鼠，剖宮取出輸卵管放入盛有M2培養液的表面皿中，顯微鏡下放入礦物油中，找到輸卵管膨大部，用解剖針稍刺破膨大部，將卵母細胞團引出，并導入到HTF培養基液滴中。

1.3.6 體外授精(IVF)：將培養1h 的精子懸浮液鏡下檢查精子活力和精子數量，用移液器吸取精液10 μL( 約含精子200個/μL) 放入培養滴中，加入卵母細胞 (50～100) 個，培養皿放CO2培養箱中培養6 h后，用預熱過的HTF培養滴清洗受精卵兩次，再放回CO2箱中過夜培養。

1.3.7 早期胚胎的形態學評價：培養24 h后的受精卵做鏡檢，統計2-細胞胚胎，未受精卵及異常卵。其中，2-細胞胚胎和未受精卵形態正常，具有完整的透明帶，不含空泡和碎片，胞質明亮均一，屬于質量好的卵；由于精子的活力，受精能力等原因，造成了一部分卵未受精，顏色發暗并帶有胞質顆粒的卵判定為死亡卵；胞質內含有碎片、部分胞質溶解判定為畸形卵；死亡卵和畸形卵都屬于異常卵。挑出正常發育的2-細胞胚胎，移植備用。

1.3.8 體內2-細胞胚胎收集：在供體鼠見栓1.5 d后，將其頸椎脫處死，剪下雙側輸卵管，在超靜工作臺中用口吸管吸取約0.2 mL的M2培養液，一端插入輸卵管的傘口，將胚胎沖出。在鏡下收集形態正常且透明帶完整的2-細胞期胚胎，放入新鮮的M2 培養滴中，移植待用。

1.3.9 假孕小鼠的準備：將SPF級ICR雌鼠與ICR結扎雄鼠 1:1合籠，第二日驗栓，有陰栓的作為受體鼠。所有實驗均在浙江大學實驗動物中心屏障系統內完成。

1.3.10 2-細胞胚胎移植：用口吸管吸25枚胚胎，末端再吸一個指示性的小氣泡。受體小鼠用戊巴比妥麻醉，剃掉小鼠背左側小面積被毛，75%酒精消毒，透過皮膚看到脂肪墊的位置剪一個縱向切口，拉出脂肪墊，牽引出卵巢、輸卵管和子宮。用脂肪夾夾住脂肪墊，固定好卵巢和輸卵管。解剖鏡下，在輸卵管的喇叭口與壺腹部之間用維納斯剪刀剪一小口，再將移卵針朝壺腹部方向插入輸卵管中，將所有胚胎吹入左側輸卵管。以輸卵管中可見指示小氣泡作為胚胎全部吹入的標志。將脂肪墊、卵巢、輸卵管一起放回腹腔中，縫合肌肉和皮膚。多余胚胎進行冷凍保存。

2 結果

2.1 剖宮取胎實驗結果

四組劑量超排后，通過剖宮取胎實驗結果見表1。從表中可知，5IU劑量組見栓率最高，見栓率和平均產仔數均差異不顯著(P>0.05)。

2.2 體外胚胎的獲得及其胚胎移植結果

四組劑量超排后，體外胚胎的獲得以及移植結果見表2。從表2可知，4組劑量超排后平均卵母細胞數、異常卵率差異顯著(P<0.05)。其中，注射10 IU實驗組平均卵母細胞數為(30.33±0.89)枚，顯著高于其它3組，5 IU組的(23.44±0.51)枚、7.5IU組的(23.33±0.67)枚，顯著高于15 IU組的(17.33±0.34)枚；5 IU組劑量的異形卵率最低，為(3.79%±0.81%)，與7.5 IU劑量組(5.24%±0.84%)差異不顯著，與10 IU、15 IU組均差異顯著，15 IU組劑量的異形卵率最高，為(8.37%±0.92%)，與其它3組均差異顯著。四個劑量組的體外受精率差異不顯著(P>0.05)；體外受精平均2-細胞胚胎數顯著差異(P<0.05)，10 IU組最高為18.78±0.39枚，與其它三組均差異顯著，5 IU組和7.5 IU組差異不顯著，15 IU組最低，為13.00士0.33枚，均顯著低于其它三組；同時，將四組劑量超排后獲得的卵母細胞進行體外受精，將獲得的2-細胞胚胎進行移植，產仔率均差異不顯著(P>0.05)。

2.3 體內2-細胞胚胎的獲得及其胚胎移植結果

四組劑量超排后，體內2-細胞胚胎的獲得及其胚胎移植結果見表3。從表中看出，平均胚胎數差異顯著(P>0.05)，移植后產仔率差異不顯著(P>0.05)。其中，10 IU組獲得的平均胚胎數最多，為18.00±0.50枚，與其它3組均存在顯著差異；其次是5 IU組，也顯著高于其它兩組，而7.5 IU組和15 IU組之間差異不顯著。

表1 四組劑量超數排卵后剖宮取胎的結果

表2 四組劑量超數排卵后體外胚胎的獲得及其移植的結果

表3 四組劑量超數排卵后體內胚胎的獲得及其移植的結果

3 討論

隨著C57BL /6J轉基因小鼠動物模型的廣泛應用，其生物凈化工作也日漸頻繁。傳統的剖宮取胎法容易導致垂直傳播的病毒凈化失敗，但由于操作比較簡單，在不具備胚胎移植技術的條件下也是一種選擇。本文嘗試通過超排的方法達到人工控制發情。通過比較，雖然小鼠的見栓率和平均產仔數沒有顯著差異，但注射5 IU劑量組的小鼠交配后見栓率最高，該劑量適用于C57BL/6J背景鼠進行剖宮取胎生物凈化，提高其受孕率。因為高劑量的激素對小鼠的內分泌會造成一定的紊亂，導致交配的失敗。因此，只要激素能激發小鼠發情，使它交配成功，激素量越少越好。實驗中發現，超排后合籠的小鼠有一部分見栓卻沒懷孕，有研究者發現大鼠相似的現象[1]。這主要是由于超排后，雌性動物體內會出現高水平的雌二醇-17β，從而刺激輸卵管的運動性，加速了胚胎的遷移，導致胚胎過早暴露于不適合其發育的內環境，造成胚胎大量丟失[2]，不利于受精卵的發育和妊娠[3]。

相對剖宮取胎，采用胚胎移植法手術時間可控性強，可最大限度避免病毒經胎盤感染仔鼠，仔鼠成活率高[4]，但它需要大量的胚胎，而胚胎的獲得分體內和體外胚胎。如果有較多生殖狀態好的轉基因雄鼠，可超排野生型雌鼠與轉基因雄鼠交配，獲得體內2-細胞胚胎進行移植。本次試驗中，注射10 IU組獲得的體內胚胎數最多，為最佳劑量。但這種方法需要較多的轉基因雄鼠，而且一次沖出的胚胎數量受限，一般建議采用IVF。當雄鼠不多或者狀態不好的情況下，更能體現出體外受精的優勢。只需一只雄鼠，超排大量野生型雌鼠，一次獲得大量的卵進行IVF，獲得大量的體外受精胚，基本能一次完成凈化工作，節約成本，提高效率。本次注射10 IU劑量組能獲得最多的卵母細胞，這與部分文獻報道有所差異[5-7]，可能與所用激素、小鼠周齡不同以及品系間存在個體差異有關[8]。本文僅就注射不同劑量的激素對C57BL /6J小鼠進行超排，初步探討超排在C57BL/6J小鼠生物凈化體系中的應用，但是超數排卵是一系列極為復雜的生理過程，影響因素很多[9-10]，其對胚胎發育和質量的影響目前仍然說法不一[11-13]，有待今后進一步深入研究。

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