Cε3-Cε4結合肽篩選及鑒定

張艷芬，劉利鵬，趙立健，時海浪，劉中成

(1.河北大學 科學技術處，河北 保定 071002；2. 河北大學 藥學院，河北 保定 071002)

自1966 年日本學者Ishizaka 發現IgE以來，人們已經明確IgE是影響變態反應性疾病的關鍵因子之一，以IgE為靶點設計藥物已經成為治療變態反應性疾病藥物研究的熱點[1-2].近年來，人們相繼開發了抗IgE抗體、抗FcεRIα抗體、IgE分子類似多肽、受體類似物以及依據抗IgE抗體效應部位設計的多肽等抑制性小分子和以IgE為基礎設計的疫苗，均取得了一定的治療效果[3-4].其中人源化抗IgE單克隆抗體Omalizumab/Xolair 以及Syk抑制劑R112在臨床上取得巨大的成功，證實了以IgE/FcεRI信號通路為靶標治療變態反應性疾病的可行性[2,5].噬菌體展示技術(phage display technology，PDT)是利用生物技術手段將一定長度的隨機寡核苷酸片斷克隆至特定表達載體中，表達產物以融合蛋白的形式表達于絲狀噬菌體表面.理論上該肽庫含有了該長度的所有可能的氨基酸排列順序，每個噬菌體或細胞呈現其中的一種肽段，因而庫容量極大，利于篩選和擴增[6].該技術已經成為揭示蛋白之間相互作用的有效工具，在單克隆抗體和先導化合物篩選、疫苗研制、抗原表位分析、受體與配體結合位點確定、分子間識別以及肽類新藥開發等方面得到了廣泛的應用[7-9].目前，未見以IgE分子恒定區Cε3-Cε4為靶標進行噬菌體肽庫篩選的相關報道，本實驗室在獲得重組Cε3-Cε4蛋白基礎上，以此為靶標，利用噬菌體展示隨機肽庫技術進行篩選，獲得了具有特異性親和力的結合肽，初步分析該結合肽可阻止IgE與其受體結合，該結果為進一步探索結合肽生物學功能提供了實驗基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

Ph.D.-12TM噬菌體隨機肽庫(1.0×1013pfu/mL，隨機多樣性為2.7×109)、-96gⅢ測序引物(NEB公司)；HRP-抗M13單抗(Amersham Pharmaeia公司)；Cε3-Cε4蛋白為本實驗室保存重組蛋白；蛋白胨、瓊脂粉、酵母粉(OXOID公司)；人淋巴瘤IgE(Chemicon公司)；鼠抗人IgE多抗 、FITC標記二抗(Sigma公司)；抗His標簽抗體(中杉金橋公司)；質粒抽提純化試劑盒、DNA提取試劑盒(上海生工公司)；其余均為國產分析純試劑.P7，P20多肽制備及測序均由上海生工公司完成.

1.2 實驗方法

1.2.1 噬菌體隨機肽庫篩選系統驗證

參照NEB公司 Ph.D.-12TM噬菌體隨機肽庫說明書，以鏈霉親和素作為靶分子，在封阻液(0.1 mol/L NaHCO3(pH8.6)，50 μg/mL BSA )中加入終質量濃度為0.1 μg/mL的鏈霉親和素以結合BSA中混有的少量生物素.用0.1 mmol/L的生物素(溶于TBS中)洗脫結合噬菌體.孵育60 min，經3輪富集/擴增后，于少于100個噬菌斑的平板上挑取5個單克隆，提取DNA后，以-96gⅢ測序引物(5′-HOCCCTCATAGTTAGCGTAACG-3′)進行測序，驗證篩選系統.

1.2.2 噬菌體隨機展示肽庫的篩選

參考噬菌體展示肽庫試劑盒說明書，用NaHCO3溶液稀釋Cε3-Cε4蛋白至100 μg/mL，每孔150 μL上述溶液，4 ℃包被過夜.除去包被液，每孔加滿封閉液，4 ℃作用1.5 h.倒掉封閉液，用TBST緩沖液快速洗板6次.用100 μL的TBST緩沖液稀釋4×1010的噬菌體(即10 μL的原始文庫)，然后加到已包被好的板上，室溫溫和搖動60 min.除去未結合噬菌體，TBST緩沖液洗板15次.用游離靶分子溶液100 μg/mL溶于TBS中，從固定靶分子上將結合的噬菌體競爭性洗脫下來.室溫溫和搖動60 min，收集洗脫液，取5 μL進行噬菌體滴度測定，剩余的擴增、純化后重復上述步驟，進行下一輪篩選.每輪篩選前后均測定噬菌體的滴度.將加入的噬菌體的量計為投入量，洗脫得到的噬菌體的量計為回收量，回收率=回收量/投入量.經過4輪淘洗，將最終的篩選產物直接進行滴度測定，挑取單克隆鑒定篩選到的噬菌體與Cε3-Cε4蛋白結合特性.

1.2.3 噬菌體展示肽與Cε3-Cε4蛋白的親和力鑒定

用質量濃度為100 μg/mL的Cε3-Cε4蛋白 (溶于0.1 mol/L的NaHCO3中，pH8.6)過夜包被酶聯板，100 μL/孔，同時每個待鑒定克隆均設置空白孔和包被靶分子不加噬菌體單克隆以及帶有His標簽的無關蛋白(本實驗室保存)作為陰性對照.去除包被液，用TBST洗6次，加滿封閉液，4 ℃濕盒內封閉2 h.去除封閉液，TBST洗滌，從第4輪篩選的平皿上隨機挑取50個單克隆噬菌體藍斑，擴增、純化后，用TBST稀釋為1×107pfu/μL，向每個樣品的陰性對照孔和靶分子包被孔中均加樣100 μL.室溫振蕩孵育2 h，TBST洗滌，加入封閉液稀釋的HRP標記的抗-M13單克隆抗體.每孔加入100 μL稀釋后的抗體，室溫振蕩孵育l h.倒掉溶液，TBST洗滌，每孔加100 μL TMB底物溶液，室溫避光作用30 min左右.每孔加50 μL 2 mol/L的硫酸溶液終止顯色反應.測OD450，以OD450值高于陰性對照3.0倍以上者定為陽性克隆，每組數據均重復3次，并取均值表示.

1.2.4 ELISA競爭抑制實驗鑒定展示肽與Cε3-Cε4蛋白的結合

用100 μg/mL的Cε3-Cε4 蛋白(溶于0.1 mol/L的NaHCO3，pH8.6)包被酶聯板，10 μL/孔，4 ℃密封濕盒中過夜.去除包被液后各孔加滿封閉液，4 ℃濕盒內封閉1～2 h.根據單克隆樣品滴度測定結果，分別將11種單克隆樣品用TBST稀釋為1×108pfu/μL，加入到包被蛋白的孔內，50 μL/孔，然后再加入用TBS稀釋的鼠抗人IgE抗體，50 μL/孔.陰性對照孔為50 μL/孔噬菌體+50 μL/孔TBS；空白對照孔為100 μL/孔TBS.37 ℃孵育1 h，加入封閉液稀釋的HRP標記抗-M13單克隆抗體，室溫振蕩孵育l h.用TBST洗滌，每孔加100 μL TMB底物溶液，進行顯色.測OD450值，按照下式計算抑制率：抑制率=(未抑制OD值-抑制后OD值)/未抑制OD值×100%.

1.2.5 體外檢測結合肽抑制IgE 與其受體FcεRIα的結合

選擇穩定表達人FcεRIα 的RBL-2H3細胞株為驗證細胞，將對數生長期RBL-2H3細胞，用2.5 μg/mL胰蛋白酶消化，7×103r/min離心30 s收集細胞，盡棄上清液； PBSS 洗滌，計數，調整細胞密度至1×105/mL；加入人骨髓瘤IgE至終質量濃度為50 ng/mL，分別加入結合肽P7，P20至以下質量濃度：0，10，20，40，80，100 μg/mL，冰上孵育 30 min，同時，設置PBS及BSA蛋白作為陰性對照； 離心，棄上清液，PBSS洗滌；加入 FITC標記的抗IgE抗體，冰上避光反應45 min；離心棄上清液，洗滌 2 次，棄盡洗液，300 μL/樣品 1%(體積分數)多聚甲醛重懸，流式細胞儀檢測細胞熒光率.

1.2.6 統計學分析

每組實驗均重復3次，結合肽生物學功能檢測結果采用兩因素析因設計的定量資料方差分析及在此基礎上的兩兩比較，其他結果采用單因素方差分析加q檢驗，用SAS8.0軟件進行統計學分析.

2 實驗結果

2.1 噬菌體隨機肽庫篩選系統驗證

對所用噬菌體肽庫進行驗證是結合肽篩選的前提，隨機挑選5個陽性單克隆噬菌體進行測序并翻譯，結果如表1所示，得到的5條鏈霉親和素結合肽有4條含有His-Pro-Gln氨基酸序列，即HPQ序列，表明本系統符合要求，可進行下一步實驗.

2.2 噬菌體的富集

篩選過程中，每次均投入相同量的噬菌體，即2.0×1010pfu.如表2所示，回收噬菌體的滴度由第1輪1.2×104pfu增加到第4輪3.6×106pfu，增加了300倍，回收率也由第1輪的0.6×10-6增至第4輪篩選后的1.8×10-4，表明與Cε3-Cε4蛋白有高親和力的噬菌體克隆得到了有效富集.

表1 噬菌體隨機肽庫篩選系統驗證

表2 隨機噬菌體短肽庫回收率

2.3 噬菌體單克隆親和力鑒定

經4輪篩選后，隨機挑取藍斑單克隆噬菌體，利用ELISA對其親和力進行鑒定(圖1).其中P7，P13，P16，P20，P22，P24，P28，P37，P43的OD450平均值均在1.50以上，P4，P6，P9，P10，P26，P30，P34，P40，P47，P50的OD450平均值均在1.07～1.50.空白對照OD450的平均值為0.195，陰性對照OD450平均值為0.355，其他31個單克隆噬菌體OD450平均值低于1.07，未在圖中表示.所以，本實驗共獲得19個陽性單克隆噬菌體，陽性率為38%.

C.空白孔；N.包被Cε3-Cε4蛋白不加噬菌體單克隆；H.包被帶有His標簽的無關蛋白.圖1 噬菌體單克隆親和力測定結果Fig.1 Affinity of phage monoclonals to Cε3-Cε4 detected by ELISA

2.4 陽性克隆噬菌體的序列分析

經ELISA檢測呈明顯陽性結果的19個單克隆樣品抽提DNA，序列測序后翻譯.根據編碼鏈中噬菌體PIII基因的閱讀框架翻譯出展示外源多肽的氨基酸序列.結果如表3，所有陽性克隆編碼氨基酸的密碼子均為NNK(N=GA或TC；K=G或T)，與理論序列相一致.19個陽性克隆編碼了11條氨基酸(表3)，其中P13，P28，P37氨基酸序列相同，P20，P24，P29氨基酸序列相同，而P22與P7及P43氨基酸序列相同，P16和P50氨基酸序列相同，P6，P9氨基酸序列相同，其他沒有完全一致的氨基酸序列.

表3 噬菌體展示肽的氨基酸序列分析

利用DNAman軟件將各短肽的氨基酸序列與IgE高親和受體FcεRIα亞基的氨基酸序列進行相似度分析，P20，P24和P29與受體FcεRIα亞基的98～118位aa有50%的相似度.而P7，P22和P43與FcεRIα的157～170位aa有25%的相似度.其他的9條結合肽盡管有一定的相似度，但位置大都不在FcεRIα亞基的D2區及W87-E132、Y149-E162區間內.

2.5 ELISA競爭抑制實驗

圖2 Cε3-Cε4蛋白結合肽競爭抑制實驗Fig.2 Analysis of Cε3-Cε4 binding peptidesby competitive inhibition ELISA

選取噬菌體ELISA檢測為陽性的11種噬菌體克隆進一步做鼠抗人IgE抗體-Cε3-Cε4蛋白競爭抑制實驗，結果如圖2所示，鼠抗人IgE抗體能不同程度和11種噬菌體克隆競爭與Cε3-Cε4蛋白結合，其中抑制率最低的是噬菌體克隆P7，P13和P20，抑制率分別為34%，35%，34.8%，其他抑制率在50%左右.表明篩選到的陽性噬菌體多肽P7，P13和P20與Cε3-Cε4蛋白的結合能力最強.

2.6 結合肽生物學功能檢測

IgE特異性結合肽與IgE結合后可阻止IgE與細胞表面受體結合，結果如圖3所示，隨著結合肽濃度的增加，細胞熒光率逐漸減少，呈顯著劑量效應，熒光率降低比例與陰性對照BSA具有顯著性差異，表明結合肽P7，P20均可與 IgE特異結合，抑制 IgE與細胞表面FcεRIα的結合.

圖3 結合肽抑制IgE與FcεRIα作用Fig.3 Inhibition of interaction between IgE andFcεRIα by Cε3-Cε4 binding peptides

3 討論

自1988年Parmley等首次對噬菌體肽庫進行有效篩選以來，該技術諸多環節不斷得到優化[10].在篩選肽庫中，必須平衡嚴謹性(stringency)與產量(yield)間的關系，有必要對篩選與洗脫條件進行優化.雖然在液相中淘選靶分子配體，可通過降低靶分子濃度來提高篩選嚴格度，但是根據說明書推薦的初始濃度10 nmol/L，最后幾輪濃度降低至1 nmol/L的方案，結果不理想.本實驗采用恒定靶分子質量濃度100 μg/L，通過延長洗滌時間與次數，并且在4 ℃條件下進行結合反應，來增加篩選的嚴格度，結果是比較理想的.結合或洗滌緩沖劑中加入去污劑Tween-20能降低噬菌體與靶分子以及封閉劑之間的非特異性作用，一般最初幾輪淘選中用較低體積分數的Tween-20增加洗脫物的滴度，然后逐漸增加Tween-20體積分數(最大可到5%)來增加選擇的嚴格性[11].本實驗對前3輪篩選進行測序未發現共同序列，所以進行4輪淘選，并逐步增加Tween-20體積分數(0.1%，0.3%，0.5%，0.5%)，獲得了親和力強、特異性好的結合噬菌體.

另外，結合和洗脫時間也是篩選的關鍵因素，結合時間短，易于篩選到快速結合的小肽；相反，洗脫時間長，易于篩選到解離速度慢的小肽，所以，可以通過縮短結合時間和延長洗脫時間的方式來提高篩選的嚴格度.在最后幾輪篩選時，洗脫可以在2個階段進行：拋棄在短時間內洗脫下來的噬菌體，而將長時間洗脫下來的噬菌體進行下一輪篩選.實驗中用100 μg/mL游離的靶分子溶液將固定靶分子上結合的噬菌體競爭性洗脫下來.結合時間為4 ℃過夜結合，洗脫時間為室溫60 min.

IgE 分子與其高親和力受體FcεRI 作用是引發Ⅰ型變態反應的關鍵步驟，IgE分子重鏈無亞類，由4個恒定區(Cε1-Cε4)組成，有文獻證實，IgE 分子重鏈區Cε3-Cε4是與FcεRI 作用的關鍵區域[12-13].因此，本文未選擇完整IgE分子作為靶蛋白，而是選擇IgE與受體的作用關鍵區域作為篩選靶標，這將增加結合肽的特異性，便于下一階段的生物學功能研究.本實驗篩選得到11條結合肽序列，搜索GENBANK數據庫，所獲得結合肽序列在一級結構上與IgE無同源性.Nakamura用IgE高親和受體FcεRI篩選隨機短肽庫，得到與之結合的肽序列CXXGPWXXXC，盡管與IgE沒有同源性，但是能夠阻斷IgE與其高親和受體結合、抑制組胺的釋放[14-15].本研究發現結合肽與其高親和受體FcεRI有一定的相似性，其中LPGAHDPWKVP與受體FcεRIα亞基的98～118位aa有50%的相似度.KMDYLPHSTSQM與FcεRIα 157～170位aa有25%的相似度，說明P7，P20與FcεRIα亞基的同源性幾率較高.通過HEX分子對接模擬分析短肽與Cε3-Cε4蛋白的結合位點，其中P7和P20有2個相同的對接位點ARG-342和GLU-472，細胞實驗也初步證實了P7和P20可干擾IgE與受體結合，推測P7和P20具有開發成治療變態反應性疾病藥物的潛質，本文為深入研究IgE結合肽功能提供了實驗基礎.

參 考 文 獻:

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