大豆蛋白的酶水解及類蛋白反應(yīng)對(duì)其抗氧化活性的影響

張向挺（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系 黑龍江省哈爾濱市150030）

前言：

大豆蛋白的類蛋白反映有利于催化蛋白質(zhì)酶水解的逆過程，其原理就是由較低的分子質(zhì)量的肽所形成一種類似與蛋白質(zhì)的混合物體，在實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)過程中受到水解作用、縮合作用、轉(zhuǎn)肽作用以及物理聚集作用的影響，而最終形成新結(jié)構(gòu)的肽，這種轉(zhuǎn)化過程影響了其生物學(xué)的活性。化學(xué)研究者通過精心鉆研后得出結(jié)論：醋蛋白的水解物的類蛋白反應(yīng)能對(duì)其抗氧化反應(yīng)起到推動(dòng)作用。為了驗(yàn)證這項(xiàng)結(jié)論，本文將通過實(shí)驗(yàn)的方法，深入研究大豆蛋白的酶水解以及隨后的類蛋白反應(yīng)對(duì)其抗氧化活性的影響。

一、材料和方法

1.材料與試劑

在做這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)之前，共準(zhǔn)備了材料：大豆分離蛋白、蛋白酶、二苯基、三硝基苯肼、連氮、鐵氰化鉀、鄰二氮菲、鄰苯三酚、其他試劑以及蒸餾水。

2.儀器與設(shè)備

為了更加準(zhǔn)確分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，還需要準(zhǔn)備紫外—可見分光光度計(jì)、自動(dòng)凱氏定氮儀、高速冷凍離心機(jī)、真空冷凍干燥機(jī)、全溫振蕩培養(yǎng)箱、精密pH計(jì)、分析天平、微型旋渦混合器遠(yuǎn)紅外恒溫干燥箱、電熱恒溫水浴鍋等設(shè)備。

3.實(shí)驗(yàn)方法

（1）堿性蛋白酶大豆蛋白水解物

首先需要配制出來濃度為100 mg/ml的大豆分離蛋白的液體，并通過2 mol/NaOH的溶液使之調(diào)整到pH值到8左右，并添加1000 U/g的蛋白酶，在50℃的恒溫水浴中進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)。根據(jù)不同的水解時(shí)間分別取出20 ml的樣品，再將浴中的水迅速升溫到100℃加熱15分鐘，待到室溫冷卻后調(diào)節(jié)pH值到4.5并分離出上清液。通過這些蛋清液測試出水解度[1]。根據(jù)測試出來的結(jié)果，確定出合適的水解時(shí)間，并放大剛剛分解出的大豆蛋白水解物，冷凍干燥后備用。

（2）三硝基苯肼自由基的清除能力測試

這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的具體步驟為：提取三硝基苯肼0.0079 g，用無水乙醇對(duì)其加以溶解，最后定容到100 ml，所配制出的溶液就是乙醇溶液，放到棕色瓶內(nèi)并在不受陽光照射的條件下保存。同時(shí)提取1 ml的三硝基苯肼溶液和2 ml的樣品溶液加以混合，同時(shí)放置在暗處保存，讓其反應(yīng)30分鐘，根據(jù)結(jié)果測定其吸光度，并通過無水乙醇來進(jìn)行空白試驗(yàn)。

（3）連氮清除能力測試

在此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，測定的連氮溶液要通過連氮溶液和硫酸鉀溶液的反映當(dāng)中產(chǎn)生，此混合物要在使用前在暗處的環(huán)境下保存12-16個(gè)小時(shí)。在測評(píng)的過程中，通過連氮溶液測試吸光度，為了讓測試結(jié)果更加合理，需要連續(xù)測試三次。

（4）還原力測試

在這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，需要提取5 mg/ml的樣品溶液1 ml將其與2.5 ml的磷酸鈉溶液與2.5 ml的鐵氰化鉀溶液混合，在30分鐘的50℃恒溫中反應(yīng)，反應(yīng)之后迅速冷卻后加入2.5 ml的10%三氯乙酸溶液，提取2.5 ml的上清液，加入2.5 ml的蒸餾水和0.5 ml的氯化鐵溶液，均勻進(jìn)行混合。在反應(yīng)10分鐘后，測定吸光度，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來測定其還原力，吸光度越大表明了還原能力越強(qiáng)。

二、結(jié)果與分析

1.大豆蛋白水解物制備

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大豆蛋白的水解物的抗氧化性會(huì)隨著水解度的增大而增大，水解時(shí)間越長，則水解度越高，對(duì)連氮的清除率也就越明顯。但如果水解時(shí)間延長的話，連氮清除率卻沒有顯著性的提高。

2.類蛋白反應(yīng)條件的優(yōu)化

利用蛋白酶等成分對(duì)所制備的大豆蛋白的水解物進(jìn)行類蛋白反應(yīng)，設(shè)定一個(gè)反應(yīng)的時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)實(shí)際的需要來分析出酶添加量、底物濃度和溫度對(duì)修飾產(chǎn)物游離氨基減少量的影響。

最后以類蛋白反應(yīng)后的產(chǎn)物游離氨基減少量當(dāng)成一個(gè)指標(biāo)，利用方程式求解的方式，得到最終的類蛋白反應(yīng)最優(yōu)條件[2]。

3.得出實(shí)驗(yàn)結(jié)論

通過該實(shí)驗(yàn)，可以看出大豆蛋白的水解物、修飾產(chǎn)物的抗氧化活性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于大豆蛋白本身，類蛋白反應(yīng)也能顯著提高大豆蛋白水解物的修飾產(chǎn)物中的抗氧化活性。因此可以得出實(shí)驗(yàn)結(jié)論：大豆蛋白的蛋白酶水解、類蛋白的反應(yīng)修飾，能夠應(yīng)用與制備高活性的大豆蛋白抗氧化肽的研究。

三、抗氧化活性肽的作用機(jī)理

自由基是獨(dú)立存在的一種化學(xué)形式，化學(xué)性質(zhì)及其活潑。自由基在通常情況下可以攻擊生命體內(nèi)的大分子物質(zhì)和細(xì)胞壁，造成機(jī)體本身的多種損傷，加速機(jī)體的老化。當(dāng)處于正常的生理?xiàng)l件下，機(jī)體中的自由基可以達(dá)到一個(gè)產(chǎn)生與自動(dòng)清除相互平衡的狀態(tài)下，但一旦機(jī)體處于不良的狀態(tài)，并隨著人類年齡的增長，機(jī)體中的自由基就會(huì)大量生產(chǎn)并且清楚緩慢[3]。針對(duì)這樣的現(xiàn)象，人們研制出一種人為的自由基清除劑，又被稱之為抗氧化劑，能夠有效清除機(jī)體當(dāng)中多余的自由基，減輕其對(duì)機(jī)體的損害。

根據(jù)目前的實(shí)際情況來看，已有的抗氧化劑一般條件下會(huì)通過五種途徑來達(dá)到抗氧化的目的：抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、直接清除活性氧自由基、清除氧、螯合金屬離子以及激活體內(nèi)本身自帶的抗氧化防御系統(tǒng)。抗氧化劑主要來源于蛋白酶的水分解物，其可以有效抑制機(jī)體內(nèi)自由基的過量積累，對(duì)清除體內(nèi)的自由基有著十分顯著的功效。

結(jié)論

人類許多的慢性病以及衰老的現(xiàn)象發(fā)生均來源于人機(jī)體內(nèi)的自由基失衡，積累了過量的自由基會(huì)對(duì)人體細(xì)胞造成嚴(yán)重的損傷。為了改善這種現(xiàn)象，人們通過蛋白酶的抗氧化劑來幫助人們維持身體的自由基平衡。本文通過實(shí)驗(yàn)研究，分析出蛋白酶水解和類蛋白反應(yīng)對(duì)于其抗氧化活性的影響，并根據(jù)此實(shí)驗(yàn)結(jié)果完善抗氧化劑的研制，以便于讓人類的機(jī)體更加健康，有效防止慢性疾病的產(chǎn)生。

[1]王鑫，江連洲，吳瑕，田瑞紅.堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白及其抗氧化活性的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，（11）:24-31.

[2]宋佳天，趙新淮.大豆蛋白的酶水解及類蛋白反應(yīng)對(duì)其抗氧化活性的影響[J].食品科學(xué)，2012，（01）:115-119.

[3]楊鋒，陳錦屏，陽顯瑩.醋蛋水解物的類蛋白反應(yīng)及對(duì)抗氧化活性的影響[J].食品工業(yè)科技，2012，（08）:152-155.