右美托咪定對高血壓腦出血大鼠血腫周圍細(xì)胞凋亡的影響

欒宏權(quán)，姚柱煒，蒙劍鋒

0 引言

高血壓腦出血(HICH)是腦血管病中病死率和致殘率很高的一種疾病。我國老年(>60歲)人口已超過1.3億，這種以老年人為主要發(fā)病人群的疾病應(yīng)當(dāng)引起研究者的重視，以探索其有效的防治措施[1]。研究表明，細(xì)胞凋亡機(jī)制參與腦出血后繼發(fā)性腦損傷[2]。右美托咪定是咪唑類衍生物，是一種高選擇性的腎上腺α受體激動劑，通過激動中樞神經(jīng)系統(tǒng)α受體最密集的區(qū)域-腦干部藍(lán)斑，引發(fā)生理非動眼睡眠狀態(tài)，產(chǎn)生鎮(zhèn)靜、催眠作用，降低血壓及心率[3]。研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定在動物腦缺血模型中有神經(jīng)保護(hù)作用，可減輕腦損傷[4]。本研究擬評價(jià)右美托咪定對高血壓腦出血大鼠血腫周圍細(xì)胞凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料與方法 健康雄性SD大鼠(青島大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部提供)150只，體重250～300 g，采用隨機(jī)數(shù)字表分為5組：對照組(C組)、假手術(shù)組(S組)、高血壓腦出血模型組(M組)、右美托咪定組(D組)和生理鹽水組(N組)，每組30只。D組于制作模型前經(jīng)腹腔注射鹽酸右美托咪定注射液100 μg/kg(批號：14030332，江蘇恒瑞)，N組注入等量生理鹽水，C組不行任何處理。

1.2 模型建立 參照文獻(xiàn)[5]制備大鼠高血壓腦出血模型。用內(nèi)徑0.2 mm的銀夾狹窄雙側(cè)腎動脈造成大鼠腎血管性高血壓，術(shù)后60 d形成穩(wěn)定的高血壓后，在立體定位下于大鼠右側(cè)向腎血管性高血壓大鼠右側(cè)尾狀核(前囟前0.2 mm，矢狀縫右3 mm，深6 mm)注入含0.4 U細(xì)菌膠原酶(Ⅶ型)的生理鹽水2 μL，誘導(dǎo)腎血管性高血壓腦出血大鼠模型。假手術(shù)大鼠麻醉、開腹、鈍性分離雙側(cè)腎動脈后關(guān)腹，60 d后向右側(cè)尾狀核內(nèi)注入2 μL生理鹽水。

1.3 檢測指標(biāo) ①神經(jīng)行為學(xué)評估：動物于制備模型結(jié)束后放回籠中進(jìn)行觀察，自由飲食。高血壓腦出血后24 h，采用雙盲法評估并記錄每只小鼠神經(jīng)行為學(xué)評分，采用Lawner等制定的評分標(biāo)準(zhǔn)[6]，包括6個(gè)方面：眼瞼下垂情況(正常，0分；一側(cè)眼瞼部分下垂，1分；一側(cè)眼瞼完全下垂，2分；兩側(cè)眼瞼部分下垂，3分；兩側(cè)眼瞼完全下垂，4分)，毛發(fā)豎立情況(正常，0分；出現(xiàn)毛發(fā)豎立，1分)，肢體肌張力(正常，0分；肌力下降，1分)，屈肌反射(正常，0分；后肢屈肌反射下降，1分；后肢完全不能屈曲，2分)，姿勢(正常，0分；伏首前傾，1分)，行走方式(正常，0分；速度減慢，1分；不能行走，2分)。②血腫周圍腦組織TUNEL染色及凋亡分析：高血壓腦出血后1、3、5 d，每組隨機(jī)選取5只大鼠，取血腫周圍約2 mm厚腦組織，4%多聚甲醛常溫固定包埋，切片，脫蠟，其余步驟按照說明書進(jìn)行。顯微鏡下采集圖像，凋亡細(xì)胞細(xì)胞核顯色為棕褐色。每張切片隨機(jī)取5個(gè)高倍鏡(400×)視野，分別計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞核個(gè)數(shù)和細(xì)胞核總數(shù)，兩者比值定義為該切片凋亡指數(shù)。③檢測大鼠血腫周圍細(xì)胞Bcl-2和Bax的表達(dá)情況：高血壓腦出血后1、3、5 d，每組隨機(jī)選取5只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉(0.45 mL/100 g)。快速冰上斷頭取腦，分離出血腫周圍約2 mm厚腦組織，迅速放入-80 ℃冰箱保存。蛋白變性，標(biāo)本于-20 ℃冰箱保存。電泳槽通電，進(jìn)行濕法轉(zhuǎn)膜。一抗反應(yīng)：脫脂奶粉配制的一抗稀釋液3 mL，加入一抗，混勻，放入轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜，趕出氣泡并封口，4 ℃過夜。洗膜，孵育二抗，洗二抗，顯影。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)行為學(xué)評估 與C組、S組比較，M組、D組和N組大鼠高血壓腦出血后24 h神經(jīng)行為學(xué)評分升高(P<0.05)；與M組比較，D組大鼠評分降低(P<0.05)；與D組比較，N組大鼠評分升高(P<0.05)。C組與S組、M組與N組評分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠HICH 24 h神經(jīng)行為學(xué)評分及各時(shí)點(diǎn)血腫周圍腦組織凋亡指數(shù)

2.2 血腫周圍腦組織原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL)染色及凋亡分析 與C組比較，M組、D組和N組大鼠高血壓腦出血后1、3、5 d時(shí)血腫周圍腦組織凋亡細(xì)胞增加(P<0.05)；與M組比較，D組凋亡細(xì)胞減少(P<0.05)；與D組比較，N組凋亡細(xì)胞增加(P<0.05)。C組與S組、M組與N組凋亡數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1、圖1。

圖1 大鼠血腫周圍腦組織TUNEL染色(×400)

2.3 檢測大鼠血腫周圍腦組織Bcl-2和Bax的表達(dá)情況 與C組比較，M組、D組和N組大鼠高血壓腦出血后血腫周圍腦組織Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；與M組比較，D組Bcl-2表達(dá)上調(diào)，Bax表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；與D組比較，N組Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。C組與S組、M組與N組Bcl-2和Bax表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2、圖2。

表2 各組大鼠高血壓腦出血后血腫周圍腦組織Bcl-2和Bax表達(dá)水平比較

圖2 各組大鼠血腫周圍腦組織Bcl-2和Bax表達(dá)情況

3 討論

高血壓性腦出血是高血壓病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，男性略多，冬春季易發(fā)。研究表明，腦出血后由于血腫占位效應(yīng)的直接損傷、繼發(fā)性腦缺血、炎癥反應(yīng)和炎癥因子的損傷作用、興奮性氨基酸的毒性作用、氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、紅細(xì)胞裂解產(chǎn)物鐵離子和血紅蛋白的神經(jīng)毒作用和血液凝固釋放的凝血酶的神經(jīng)毒作用等因素導(dǎo)致血腫周圍組織細(xì)胞凋亡，因此，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的發(fā)生成為腦出血治療的新靶點(diǎn)[7]。

B細(xì)胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)家族的Bcl-2、Bax基因組成一個(gè)平衡體系，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。Bcl-2基因表達(dá)的產(chǎn)物主要位于線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核膜上，其功能與抑制細(xì)胞凋亡、延長細(xì)胞生存有關(guān)。Bcl-2蛋白可抑制多種損傷因素導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，而Bax的生物作用與Bcl-2相反，當(dāng)Bax表達(dá)增高可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此，本研究采用Bcl-2和Bax反映老齡大鼠短暫腦缺出血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡情況。

本研究參照文獻(xiàn)[5]制備大鼠高血壓腦出血模型。結(jié)果顯示，M組大鼠高血壓腦出血后24 h神經(jīng)行為學(xué)評分升高，血腫周圍腦組織凋亡細(xì)胞增加，提示大鼠高血壓腦出血模型制備成功。參照文獻(xiàn)[8]選擇腹腔注射鹽酸右美托咪定100 μg/kg。結(jié)果顯示，腹腔注射右美托咪定后，大鼠高血壓腦出血后24 h神經(jīng)行為學(xué)評分降低，1、3、5 d時(shí)血腫周圍腦組織凋亡細(xì)胞減少，Bcl-2表達(dá)上調(diào)，Bax 表達(dá)下調(diào)，提示右美托咪定可能通過上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Bax表達(dá)，抑制大鼠高血壓腦出血血腫周圍組織細(xì)胞凋亡，從而減輕腦損傷。其機(jī)制可能是通過Madm-2抑制P53的活性，下調(diào)Bax和上調(diào)Bcl-2表達(dá)，產(chǎn)生抗凋亡作用[9]；通過α2-腎上腺素受體—腺苷酸環(huán)化酶通道，增加磷酸化的FAK含量，再介導(dǎo)FAK-Ras-MAPK通路和FAS-PI3K通路，上調(diào)Bcl-2表達(dá)的同時(shí)下調(diào)Bax的表達(dá)，發(fā)揮抗凋亡作用[10]；降低大腦缺血的大鼠血漿中的兒茶酚胺的濃度[11]，產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，右美托咪定可抑制高血壓腦出血大鼠血腫周圍腦組織細(xì)胞凋亡，從而減輕腦損傷，其機(jī)制可能與上調(diào)血腫周圍腦組織Bcl-2表達(dá)和下調(diào)Bax表達(dá)有關(guān)，更多保護(hù)機(jī)制有待在今后的研究中進(jìn)一步證實(shí)。

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