乙型肝炎病毒外膜大蛋白檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值及其研究進(jìn)展

劉金濤

(呼和浩特市第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古呼和浩特010031)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是已知感染人類最小的DNA病毒。HBV感染不僅可以引起急性乙型病毒性肝炎(acute hepatitis B，AHB)、慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B，CHB)，還與肝硬化(liver cirrhosis，LC)、肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。近年隨著對(duì)HBV外膜大蛋白(large surface protein，LP)在HBV感染、復(fù)制及用于制備重組疫苗［1-2］、藥物［3］等方面的探究，使其作為新的、更有價(jià)值的、可靠的乙型肝炎抗病毒治療(antiviral treatment for hepatitis B，ATHB)監(jiān)測(cè)的血清免疫學(xué)指標(biāo)之一，受到臨床廣泛關(guān)注。

一、HBV-LP是唯一一種具雙重拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、致肝細(xì)胞毒性、能反式激活增強(qiáng)病毒復(fù)制作用的外膜蛋白

1.HBV-LP獨(dú)特雙重拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)是其發(fā)揮多種功能作用依賴性結(jié)構(gòu) HBV的3個(gè)外膜蛋白是從一個(gè)ORF的3個(gè)不同起始位點(diǎn)與相同終止位點(diǎn)翻譯表達(dá)而來(lái)。HBV外膜蛋白不僅能組裝成病毒包膜，還能組裝成不含有核酸的小球形顆粒和亞病毒管狀顆粒(subviral particles，SVPs)。HBV感染人體后在血清中以此3種病毒顆粒不同比例存在。在肝內(nèi)病毒非復(fù)制期HBV-LP在血清中很低或無(wú)，大量滯留在肝細(xì)胞中。在病毒粒子成熟過(guò)程中HBV-LPPreS結(jié)構(gòu)域停留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)胞質(zhì)面，通過(guò)S結(jié)構(gòu)Ⅱ型信號(hào)和疏水C端跨過(guò)ER膜，約50%HBVLP跨膜區(qū)域的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)在翻譯后發(fā)生改變，使PreS區(qū)域暴露于病毒粒子表面，從而產(chǎn)生HBVLP獨(dú)特立體構(gòu)象雙重拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。

2.HBV-LP是致肝細(xì)胞損傷、死亡和纖維化病變主因 HBV-LP存在于Dane顆粒和SVPs上，是病毒形成完整外膜重要標(biāo)志，與病毒復(fù)制、病毒顆粒組裝和從細(xì)胞內(nèi)釋放調(diào)節(jié)密切相關(guān)。可根據(jù)HBV-LP有無(wú)來(lái)判斷HBV攜帶者體內(nèi)的HBV是否在進(jìn)行復(fù)制。HBV-LP轉(zhuǎn)錄激活功能是由PreS2區(qū)域細(xì)胞質(zhì)定位所產(chǎn)生的，可能使HBV攜帶者患HCC的可能性增大。目前認(rèn)為HCC發(fā)展是由體內(nèi)HBV-LP連續(xù)過(guò)表達(dá)造成的，過(guò)量HBV-LP在肝細(xì)胞ER積聚是導(dǎo)致ER應(yīng)急的關(guān)鍵因素［4］，并導(dǎo)致肝細(xì)胞毒性甚至致癌。在對(duì)肝細(xì)胞有直接毒性作用的HBV表達(dá)抗原中只有HBV-LP有直接肝細(xì)胞毒性。毛玻璃樣變是感染HBV晚期非復(fù)制狀態(tài)肝細(xì)胞典型形態(tài)學(xué)特征，PreS1和PreS2區(qū)突變導(dǎo)致乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)在ER滯留并誘導(dǎo)ER應(yīng)激。HBV-LP的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致一些控制細(xì)胞增殖的激酶［蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、c-Raf-1激酶］的活化，這些酶的連續(xù)活化可能與HCC的發(fā)生有一定的相關(guān)性。據(jù)癌癥發(fā)生機(jī)制多因子模型，HBV-LP連續(xù)表達(dá)也可能具腫瘤促發(fā)功能。有研究表明，HBV-LP通過(guò)觸發(fā)PKCα/RAF1 SRC/PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生，這是揭示HBV相關(guān)HCC發(fā)病機(jī)制的新見解［5］。

3.HBV-LP的多功能性 由病毒編碼的蛋白和蛋白結(jié)構(gòu)域都具多種功能，HBV-LP亦是。HBV感染通常導(dǎo)致超過(guò)104倍病毒粒子SVPs的合成。SVPs包含宿主細(xì)胞來(lái)源的脂質(zhì)和病毒衣殼蛋白，不具有核衣殼和核酸。HBV的衣殼HBV-LP在病毒生活周期中具有一系列不同的功能，可致病毒復(fù)制激活［6］。感染早期與細(xì)胞受體結(jié)合介導(dǎo)病毒粒子的細(xì)胞內(nèi)攝入;感染晚期其對(duì)于病毒粒子的組裝和分泌十分重要。HBV-LP的PreS1區(qū)和PreS2區(qū)有一個(gè)與翻譯不同步的轉(zhuǎn)位過(guò)程，在橫跨ER膜時(shí)指向ER的胞質(zhì)側(cè)，HBV-LP上的PreS2區(qū)段在翻譯后初期定位于ER的胞質(zhì)側(cè)，能夠激活多種啟動(dòng)子元件，具同樣轉(zhuǎn)錄激活功能。HBV-LP在病毒進(jìn)入肝細(xì)胞時(shí)作為受體蛋白起作用，在病毒組裝時(shí)則是基質(zhì)類似蛋白，同時(shí)還行使調(diào)節(jié)功能，這種多功能性依賴于 HBV-LP PreS區(qū)獨(dú)特的雙重拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。有學(xué)者通過(guò)鴨肝模型研究發(fā)現(xiàn)，含有嗜肝病毒血清的感染性大小依賴于具有感染性的Dane顆粒的多少，還依賴于缺乏核酸、富含HBV-LP的亞病毒顆粒的數(shù)量，后者主要包括管狀顆粒和小球形顆粒，這些顆粒有反式激活作用，能顯著增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)的病毒復(fù)制和基因表達(dá)［7］。有研究表明HBV-LP超量表達(dá)會(huì)通過(guò)反式調(diào)控作用使SVPs不會(huì)分泌，形成亞病毒包膜纖維體，其在細(xì)胞內(nèi)積累可導(dǎo)致肝細(xì)胞液泡化和細(xì)胞凋亡。

二、HBV-LP檢測(cè)的臨床應(yīng)用價(jià)值

1.HBV-LP是從蛋白水平進(jìn)行患者機(jī)體內(nèi)病毒復(fù)制監(jiān)測(cè)及療效判斷的良好指標(biāo)之一 HBVLP檢測(cè)對(duì)隱匿性HBV感染具重要價(jià)值［8］，有研究表明HBV-LP的敏感性和特異性分別為64.89%和99.68%，HBV DNA的敏感性和特異性分別為60.63%和 100.00%(P＜0.05)［9］。HBV-LP作為判斷HBV復(fù)制水平指標(biāo)，并參與對(duì)肝細(xì)胞的損傷［10］。HBV-LP PreS區(qū)具有的較復(fù)雜的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)致PreS1檢出率較低，不能很好地反映HBV復(fù)制情況。對(duì)乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)陰性患者HBV復(fù)制的評(píng)估是臨床亟需解決的課題之一，HBV-LP對(duì)于判斷HBeAg陰性患者體內(nèi)復(fù)制具重要臨床意義，是反映HBeAg陰性和低水平HBV DNA患者體內(nèi)病毒復(fù)制、疾病進(jìn)程、療效與預(yù)后判斷的敏感指標(biāo)。由于持續(xù)免疫壓力、長(zhǎng)期治療，HBV preC基因1896位發(fā)生G→A點(diǎn)突變，產(chǎn)生了一個(gè)新終止密碼子(TAG)，阻斷了HBeAg形成致臨床發(fā)生HBeAg陰性，HBV DNA下降趨于轉(zhuǎn)陰，難以依據(jù)HBeAg確定治療時(shí)機(jī)［11］。新近研究也表明 HBV-LP與HBV 感染、復(fù)制及預(yù)后密切相關(guān)［12］，較 PreS1、PreS2、HBV DNA、HBeAg 敏感［13］。我國(guó) 10% 人群攜帶 HBV，其中10%～20%可發(fā)展為L(zhǎng)C，HBeAg陰性CHB患者在不斷增加，我國(guó)CHB患者尤其是LC患者中HBeAg陰性者高達(dá)60%以上［14］，探索簡(jiǎn)單、低廉判定HBV復(fù)制血清學(xué)指標(biāo)成為研究熱點(diǎn)之一。HBV-LP與HBV DNA在HBeAg陰性者中具較大差異［15］，HBV-LP與HBV DNA對(duì)乙型肝炎診治及預(yù)后評(píng)估有互補(bǔ)作用［16］。對(duì)于抗HBe患者，因HBV DNA量與CHB肝臟炎癥程度無(wú)關(guān)，定期開展聯(lián)檢，結(jié)合肝功能等進(jìn)行綜合評(píng)判肝損情況是進(jìn)行科學(xué)合理治療的根本。HBV-LP、HBV DNA及HBV血清標(biāo)志物聯(lián)檢有助于疾病診斷、療效觀察及預(yù)后判斷［17］。有研究表明HBV-LP與突變患者和非突變的患者HBV DNA水平呈正相關(guān)［18］，表明患者體內(nèi)HBVLP與病毒復(fù)制程度密切相關(guān)，而且不受 HBV YMDD變異的影響。

2.HBV-LP有望成為新的更有價(jià)值的ATHB監(jiān)測(cè)指標(biāo) 目前ATHB只能抑制共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)再?gòu)?fù)制，并不能抑制已經(jīng)形成的病毒表達(dá)蛋白，富含HBV-LP亞病毒顆粒在一段時(shí)間內(nèi)仍存在。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)HBV-LP可作為病毒復(fù)制和療效判定的重要指標(biāo)［20-21］。臨床針對(duì)HBV感染、復(fù)制、療效觀察和預(yù)后判斷等血清學(xué)指標(biāo)很多，但均具一定局限性。HBV DNA拷貝數(shù)和HBV-LP水平具良好相關(guān)性［19］。因HBV基因變異頻繁，HBV-LP可彌補(bǔ)由 HBV變異引起的HBeAg檢測(cè)不足［22］，在一定程度上反映了乙型肝炎患者肝功能狀況［23］。HBeAg轉(zhuǎn)陰、抗 HBe陽(yáng)性患者仍存在病毒復(fù)制，對(duì)于HBeAg陰性CHB患者，HBV-LP檢測(cè)反映病毒復(fù)制優(yōu)于 HBV DNA，HBV-LP有指導(dǎo)治療、判斷預(yù)后的作用［24］，二者具互補(bǔ)作用，甚至在基層可替代HBV DNA測(cè)定［25］。HBV-LP利于對(duì)CHB預(yù)后監(jiān)測(cè)，防止或延緩LC或HCC的發(fā)生、發(fā)展，是監(jiān)測(cè)HBeAg陰性HBV感染者病毒復(fù)制、病情進(jìn)程，判斷療效、預(yù)后及ATHB效果的敏感指標(biāo)，可提高乙型肝炎患者血清學(xué)診斷水平［26］。HBV-LP尚不能完全代替HBV DNA的檢測(cè)來(lái)反映HBV復(fù)制情況，但可作為HBV DNA的有效補(bǔ)充和加強(qiáng)［27-28］。HBV血清標(biāo)志物模式多樣且復(fù)雜，HBV-LP在HBV感染、復(fù)制和刺激機(jī)體免疫應(yīng)答方面均起重要作用。HBV血清標(biāo)志物與HBV DNA的復(fù)制表達(dá)差別較大，HBV血清標(biāo)志物陽(yáng)性者無(wú)論何種組合模式均存在病毒復(fù)制的可能，HBV-LP是HBV血清標(biāo)志物較好的補(bǔ)充［29］。不同肝病病種中HBV-LP有差異性［30］。由于機(jī)體對(duì)HBV免疫應(yīng)答是造成肝組織破壞和肝功能損害的主要機(jī)制，不能完全以HBV DNA來(lái)判斷患者肝功能好壞。在條件有限的實(shí)驗(yàn)室，尤其是HBeAg陽(yáng)性患者如不具HBV DNA檢測(cè)條件可通過(guò)PreS1和抗HBV核心抗體IgM(HBcIgM)判定HBV復(fù)制及肝損。HBV-LP反映HBV復(fù)制對(duì)ATHB更具重要價(jià)值，是ATHB中的CHB患者的病程、療效與預(yù)后判斷的重要指標(biāo)［31］。拉米夫定對(duì)CHB HBV DNA的殘留陽(yáng)性也意味著肝細(xì)胞內(nèi)殘留病毒的高復(fù)制能力。拉米夫定雖能明顯降低HBV DNA水平，使丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶恢復(fù)正常，但治療停藥時(shí)間很難把握，即使部分病例按臨床應(yīng)用指導(dǎo)意見停藥，仍出現(xiàn)病毒復(fù)發(fā)。隨著ATHB手段的不斷發(fā)展，原有監(jiān)測(cè)指標(biāo)已不能滿足醫(yī)患雙方對(duì)CHB治療結(jié)果評(píng)估的需要，HBV DNA陰轉(zhuǎn)、HBeAg陰轉(zhuǎn)不表示病毒停止復(fù)制［32］，有部分患者慢慢發(fā)展成為L(zhǎng)C或HCC。ATHB中動(dòng)態(tài)檢測(cè)HBV-LP可用于評(píng)估抗病毒療效［14，20］，不論其檢測(cè)方法還是臨床應(yīng)用都具其獨(dú)特優(yōu)越性。但HBV-LP是否能夠作為HBeAg陰性ATHB終點(diǎn)的有效判定指標(biāo)，尚待進(jìn)一步探討［33］。有研究表明HBeAg陰性患者血清HBV-LP水平(≥3.889 mg/mL)在基線水平不應(yīng)該被建議接受阿德福韋酯治療［34］。

3.對(duì)HBV-LP高含量母親的新生兒采取更有效措施是密切需要解決的問(wèn)題 正確評(píng)估HBV宮內(nèi)感染率將有助重新認(rèn)識(shí)HBV宮內(nèi)感染問(wèn)題的嚴(yán)重性，HBV攜帶者孕婦不同HBV-LP可反映其傳染性強(qiáng)弱，進(jìn)而估計(jì)HBsAg陽(yáng)性孕婦胎兒發(fā)生宮內(nèi)感染危險(xiǎn)性的高低［35］。攜帶HBV的孕婦尤其是HBsAg和HBeAg陽(yáng)性孕婦，其子代感染風(fēng)險(xiǎn)約為88%～90%。我國(guó)每年約150萬(wàn)HBV攜帶者分娩，約80萬(wàn)兒童可能通過(guò)母嬰垂直傳播被感染。如不加預(yù)防，這些子代幾乎全部將在出生后1年內(nèi)成為HBsAg陽(yáng)性HBV攜帶者。嬰幼兒期感染建立了免疫耐受，感染者往往成為慢性甚至終身HBV攜帶者，易致LC甚或HCC。新生兒使用聯(lián)合免疫后，母親HBV-LP量仍影響著新生兒免疫效果。HBV宮內(nèi)感染已成為乙型肝炎高發(fā)區(qū)嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問(wèn)題［36］。

4.HBV-LP可廣泛應(yīng)用于公共體檢領(lǐng)域HBV-LP作為判斷肝內(nèi)病毒繼續(xù)復(fù)制或復(fù)制活躍程度的指標(biāo)，在出國(guó)勞務(wù)人員健康體檢中具有較高的應(yīng)用價(jià)值，有助于體檢單位評(píng)價(jià)體檢者的健康狀態(tài)［37-38］。

三、HBV-LP研究進(jìn)展

1.檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)展 20世紀(jì)80年代HBVLP PreS與HBV復(fù)制關(guān)系已引起廣泛關(guān)注，其意義得到公認(rèn)。但檢測(cè)手段缺乏，應(yīng)用不廣。20世紀(jì)90年代從蛋白組成上認(rèn)為PreS1是HBV-LP所獨(dú)有，其作為新標(biāo)志一直是HBV檢測(cè)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)，PreS區(qū)研究是將PreS1和PreS2作為獨(dú)立單元進(jìn)行的。90年代中期，我國(guó)已有PreS商品化定性試劑，僅能檢測(cè)到微弱抗PreS1產(chǎn)生。90年代末，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院馬賢凱等使用基因重組PreS制備多抗組裝成試劑盒，在HBsAg、HBeAg、抗HBc均陽(yáng)性及HBsAg、抗HBe、抗 HBc均陽(yáng)性中檢出率無(wú)顯著差異，與HBV復(fù)制的相關(guān)性也不夠高。由于HBV-LP表達(dá)具有很強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)滯留性，HBV-LP PreS難以體外重組表達(dá)，同時(shí)該HBV-LP極容易降解，將HBV-LP PreS區(qū)作為一個(gè)整體對(duì)其蛋白功能研究相對(duì)較少。國(guó)內(nèi)近期才有完整表達(dá)PreS區(qū)抗原的成功［39］。國(guó)外對(duì)于S區(qū)抗原檢測(cè)研究始于1984年，Klaus等用HBV感染者的血清分離出HBV顆粒，分離出一株P(guān)reS1區(qū)線性表位aa31-33區(qū)段的單抗，但未在臨床診斷中應(yīng)用。90年代至今，針對(duì)PreS區(qū)蛋白整體性構(gòu)象型蛋白研究日益受到重視。有研究證明HBV-LPPreS區(qū)具HBsAg眾多免疫表位，由HBVLP組裝成的亞病毒顆粒能夠反式激活病毒繼續(xù)復(fù)制，有相關(guān)乙型肝炎鴨模型證實(shí)，這對(duì)臨床具實(shí)際意義。臨床上一定比例［HBsAg、抗 HBe、抗HBc均陽(yáng)性］患者ATHB后(HBV DNA低拷貝數(shù))存在亞病毒顆粒［PreS(陽(yáng)性)］。對(duì)HBV外膜蛋白深入研究發(fā)現(xiàn)HBV-LP在完整病毒外殼組裝過(guò)程中起著決定性作用。整個(gè)PreS區(qū)都暴露在病毒顆粒的表面，HBV-LP在穿越ER時(shí)需要形成雙重拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，HBV-LP折疊使PreS區(qū)形成一個(gè)結(jié)構(gòu)型依賴的區(qū)域。表位構(gòu)成方式至少有2種:線性表位和構(gòu)象表位。病毒抗原的免疫檢測(cè)研究中，大多都采用病毒的部分基因重組抗原或合成多肽制作的單抗。近年逐漸認(rèn)識(shí)到合成多肽一般只具線性表位，而不具抗體所識(shí)別的構(gòu)象型表位。當(dāng)病毒優(yōu)勢(shì)抗原表位是具有立體空間構(gòu)象型的抗原表位時(shí)，采用基因重組或合成肽的抗原制作的單抗其檢測(cè)病毒抗原的敏感性必定受到影響，最好的辦法是采用病毒樣顆粒上天然抗原決定簇或能模擬其結(jié)構(gòu)的重組蛋白來(lái)制作出針對(duì)其構(gòu)象型表位的單克隆抗體。針對(duì)HBV-LP拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特異性單抗是檢測(cè)HBV-LP的較好選擇。近年通過(guò)蛋白修飾等技術(shù)已可在體外完整表達(dá)并純化出HBV-LP，從而使HBV-LP相關(guān)功能研究成為可能。

2.最新研究成果 HBV感染與HCC高度相關(guān)。Dorobantu等［40］報(bào)道膽固醇在維持 HBV-LP獨(dú)特的雙重拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上是非常重要的，這是病毒外膜的關(guān)鍵。而α-酸性葡萄糖苷酶代謝異常是惡性轉(zhuǎn)化的標(biāo)志［41］，這些研究表明了HBV-LP受脂類、碳水化合物代謝的影響。HBV-LP PreS突變被認(rèn)為是HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌變的關(guān)鍵。研究結(jié)果強(qiáng)烈表明，HBV與C53的結(jié)合是一個(gè)新的負(fù)調(diào)節(jié)點(diǎn)反應(yīng)，這可能是引起HCC的HBV潛在的新機(jī)制［42］。Mun 等［43］揭示 F141L 在HBV-LP 誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化中起重要作用，F(xiàn)141L突變可作為HCC診斷標(biāo)志物。以往的研究表明HBV PreS2變異是一個(gè)重要的發(fā)展成HCC的風(fēng)險(xiǎn)，但其與化療藥物治療間的關(guān)系仍不清楚，Hung等［44］的結(jié)果提示，HBV PreS2在增加 Bcl-2的表達(dá)中起著重要作用，這提供了一個(gè)重要的HBV PreS2相關(guān)腫瘤化療策略。為了阻止病毒進(jìn)入，幾個(gè)基于酰化PreS1抗原衍生肽和短PreS1蛋白結(jié)合肽的方法目前正在研究中，已成為新的抗病毒治療靶點(diǎn)［45］。

目前臨床檢測(cè)HBV復(fù)制的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)各有其臨床意義，但是他們或缺乏特異性，或較難在基層醫(yī)院普及和推廣。廣泛使用的抗病毒藥物雖有一定療效，尚無(wú)有效合理評(píng)價(jià)療效的指標(biāo)，無(wú)法確定停藥時(shí)間，停藥后是否會(huì)復(fù)發(fā)或反彈亦缺乏有效預(yù)示指標(biāo)。隨著HBV-LP在乙型肝炎發(fā)病機(jī)制、感染與病毒復(fù)制等方面研究地逐漸深入，以及分子生物學(xué)、免疫學(xué)和計(jì)算機(jī)等技術(shù)的迅速發(fā)展，HBV-LP具有越來(lái)越重要的臨床價(jià)值，為積極尋找臨床隱匿性HBV感染的檢測(cè)策略提供了血清學(xué)參考。

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