膠體金免疫層析法檢測(cè)飼料中玉米赤霉烯酮的殘留

劉宏軍 馮才茂 王瑟如 吳發(fā)振 余厚美 仲曉蘭

（①江蘇省泰州市姜堰區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 225500 ②北京勤邦生物技術(shù)有限公司）

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)為一種白色結(jié)晶，又稱(chēng)F-2毒素，是由禾谷鐮刀菌等菌種產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物。ZEN主要污染玉米、高粱、小麥、大麥等糧谷類(lèi)作物及其制品。受到ZEN污染的乳制品、肉制品等動(dòng)物源性食品，會(huì)對(duì)動(dòng)物及人類(lèi)造成危害，主要表現(xiàn)在影響和破壞生長(zhǎng)發(fā)育及生殖系統(tǒng)方面，人畜誤食含有該毒素的食物后，會(huì)引起雌性激素中毒癥，造成生殖系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p傷。此外，ZEN及其衍生物對(duì)肝臟系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)均有很大的危害，并且有引發(fā)腫瘤的可能性[1,2]。

目前大多數(shù)國(guó)家對(duì)食品、谷物、飼料中的玉米赤霉烯酮含量都有十分嚴(yán)格的規(guī)定。例如澳大利亞規(guī)定谷物中玉米赤霉烯酮的含量不能超過(guò)0.05mg/kg；意大利規(guī)定在谷物和谷類(lèi)產(chǎn)品中玉米赤霉烯酮的含量不能超過(guò)0.1mg/kg；而在法國(guó)，植物油和谷類(lèi)當(dāng)中玉米赤霉烯酮的含量必須低于0.2mg/kg。中國(guó)則規(guī)定配合飼料、玉米中的玉米赤霉烯酮含量不得超過(guò)500ng/g。

玉米赤霉烯酮的分析測(cè)定一般采用薄層色譜法(TLC)、酶聯(lián)吸附免疫法(ELISA)和高效液相色譜法(HPLC)[3-9]。TLC法繁瑣費(fèi)時(shí)，且靈敏度、特異性較差，提取過(guò)程中所需有機(jī)溶劑品種多且量大，易污染環(huán)境，對(duì)人體有較大危害。常規(guī)的HPLC法雖然比TLC靈敏度高，但由于樣品前處理手續(xù)繁瑣，操作復(fù)雜，不宜推廣。以上包括ELISA法在內(nèi)的幾種方法均耗時(shí)較長(zhǎng)，而隨著商品經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們對(duì)時(shí)間概念的加強(qiáng)，無(wú)論是商家還是政府部門(mén)對(duì)檢測(cè)時(shí)間的要求越來(lái)越高，因此，膠體金試紙條作為一種快速檢測(cè)技術(shù)，能很好的解決這個(gè)問(wèn)題，提高檢測(cè)效率，縮減檢測(cè)時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

飼料樣品購(gòu)自市場(chǎng)；玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；玉米赤霉烯酮快速檢測(cè)試紙條來(lái)自北京勤邦生物技術(shù)有限公司；微量移液器購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試樣制備 樣本前處理方法：稱(chēng)取5.0±0.05g粉碎的飼料樣品至50ml聚苯乙烯離心管中，加入5ml甲醇，將瓶塞蓋緊，振蕩5min；室溫(20～25℃)，3000r/min以上離心5min；移取0.1ml上清液至盛有0.9ml樣本復(fù)溶液的2ml聚苯乙烯離心管中混勻，渦動(dòng)30s。陰性飼料樣品：空白飼料樣品經(jīng)前處理后，配制成濃度分別為0和該試紙條檢測(cè)限下限的1/2。陽(yáng)性飼料樣品：空白飼料樣品經(jīng)前處理后，配制成濃度分別為該試紙條檢測(cè)限和檢測(cè)限的2倍。

1.2.2 試紙條的使用步驟 用吸管吸取稀釋后的待檢樣品溶液垂直滴加3滴于加樣孔；液體流動(dòng)時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，反應(yīng)5～10min，判定結(jié)果。

1.2.3 結(jié)果判定 如果C線和T線都顯色，無(wú)論顏色深淺，均表示飼料樣品中玉米赤霉烯酮濃度低于檢測(cè)限，為陰性結(jié)果；如果C線顯色，T線不顯色，表示飼料樣品中玉米赤霉烯酮濃度等于或高于檢測(cè)限，為陽(yáng)性結(jié)果；如果未出現(xiàn)C線，表明不正確的操作過(guò)程或試紙條已變質(zhì)失效(如附圖)。

附圖 玉米赤霉烯酮快速檢測(cè)試紙條示意圖

1.2.4 檢測(cè)限的測(cè)定 用玉米赤霉烯酮試紙條分別對(duì)添加不同濃度的陰性飼料、陽(yáng)性飼料進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品做2個(gè)重復(fù)，記錄每種呈現(xiàn)陽(yáng)性的最低濃度值。如果檢測(cè)限下限濃度的陽(yáng)性飼料樣品不呈現(xiàn)陽(yáng)性，則根據(jù)檢測(cè)限(檢測(cè)限有下限和上限的則在檢測(cè)限內(nèi)選擇更高的濃度進(jìn)行檢測(cè))配制濃度更高的陽(yáng)性飼料樣品進(jìn)行檢測(cè)，直至出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果為止。

1.2.5 假陽(yáng)性率的測(cè)定 取空白的飼料樣品50份，制備B1、B2、B3、……、B50等100份陰性飼料樣品。對(duì)陰性飼料樣品用試紙條檢測(cè)，每個(gè)樣品做2個(gè)重復(fù)，統(tǒng)計(jì)假陽(yáng)性數(shù)，按照下面的公式計(jì)算假陽(yáng)性率。

1.2.6 假陰性率的測(cè)定 取空白的飼料樣品50份，制備B1、B2、B3、……、B50等100份陽(yáng)性飼料樣品，對(duì)陽(yáng)性飼料樣品用試紙條檢測(cè)，每個(gè)樣品做2個(gè)重復(fù)，統(tǒng)計(jì)假陰性數(shù)，按照下面的公式計(jì)算假陰性率。

2 結(jié)果

用玉米赤霉烯酮試紙條對(duì)飼料進(jìn)行了檢測(cè)限、假陽(yáng)性率、假陰性率驗(yàn)證，結(jié)果如附表。

附表 試紙條檢測(cè)結(jié)果

3 討論

玉米赤霉烯酮試紙條的檢測(cè)限為500ng/g，符合GB 13078.2-2006《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 飼料中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的允許量》。同時(shí)，國(guó)內(nèi)外對(duì)于快速檢測(cè)技術(shù)的一個(gè)基本原則是：絕不能有假陰性，但允許有假陽(yáng)性，按照農(nóng)業(yè)部獸藥殘專(zhuān)家委員會(huì)《獸藥殘留檢測(cè)試紙條(條、卡)備案技術(shù)資料要求及審查工作程序》，快速試紙條的假陽(yáng)性率應(yīng)小于5%。本試紙條符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和該備案技術(shù)要求。

玉米赤霉烯酮試紙條操作簡(jiǎn)便，結(jié)果容易觀察，不需要任何設(shè)備，整個(gè)操作時(shí)間僅需5～10min，相對(duì)與儀器等方法，具有工作量小，成本低的明顯優(yōu)勢(shì)，十分適用于我國(guó)基層檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室、政府部門(mén)的市場(chǎng)監(jiān)控檢測(cè)、臨時(shí)抽檢、排查工作，能夠?qū)崿F(xiàn)生物技術(shù)在食品安全流通消費(fèi)領(lǐng)域的方便、快速檢測(cè)[10]。

[1]余濤, 李大剛, 鄧寧等.玉米赤霉烯酮多克隆抗體的制備及特性分析[J].食品與機(jī)械.2012, 28(1):78-81.

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