靶向抗腫瘤藥物傳遞系統的制備與表征

單玲玲，高貴珍，曹穩根，吳 超，陳紅玲

宿州學院生物與食品工程學院，藥物生物技術研究所，安徽宿州，234000

靶向抗腫瘤藥物傳遞系統的制備與表征

單玲玲，高貴珍，曹穩根，吳 超，陳紅玲

宿州學院生物與食品工程學院，藥物生物技術研究所，安徽宿州，234000

紫杉醇作為抗惡性腫瘤臨床藥物具有較好的療效，但由于紫杉醇具有結構復雜、難溶于水、生物利用度差等缺點，限制了其在臨床上的應用。本實驗將多種腫瘤細胞表面高表達受體的轉鐵蛋白作為藥物傳遞系統“導向基團”，以精氨酸為連接轉鐵蛋白與紫杉醇藥物的Linker,并用熒光染料FITC標記紫杉醇前藥， 制備熒光標記的轉鐵蛋白-精氨酸-紫杉醇靶向傳遞系統(Tf-FITC-Arg-PTX)，采用TLC示蹤，LC-MS分子量鑒定，紫外分光光度法及SDS電泳進行表征，并用LPSA對制備的藥物傳遞系統進行粒徑大小的考察，實驗結果證明已成功制備熒光標記的靶向抗腫瘤藥物傳遞系統，且轉鐵蛋白在修飾前后其粒徑大小沒有明顯的變化。

轉鐵蛋白;紫杉醇;熒光標記;表征

惡性腫瘤嚴重威脅著人類的生命健康，腫瘤的早期診斷與有效治療是當前亟待解決的問題。臨床一線抗癌化學藥多數為細胞毒性藥物，存在藥物劑量-療效依賴性，以增加劑量達到較好的藥物療效，這樣加重了藥物毒性反應，也限制藥物的臨床應用[1]。因此，如何利用靶向性藥物傳遞系統提高抗腫瘤化學藥物的局部濃度，減小全身毒副作用,一直是研究者的熱門話題。

轉鐵蛋白(Transferrin, Tf)是一種結合鐵的β-球蛋白，存在于脊椎動物體液及細胞中，包括血清轉鐵蛋白、卵轉鐵蛋白和乳轉鐵蛋白三種類型，其中血清所含轉鐵蛋白含量最多。血清轉鐵蛋白含有679個氨基酸殘基，這為修飾蛋白表面提供眾多的活性位點。轉鐵蛋白受體(Transferrin receptor，TfR)作為一種跨膜糖蛋白，在多種惡性腫瘤細胞表面(如乳腺癌、膀胱癌、肝癌、肺癌等細胞)都有高表達[2-3]，且惡性腫瘤細胞表面轉鐵蛋白受體與配體的親和力是正常細胞的10～100倍[4]，因此，可利用轉鐵蛋白受體-配體的介導，將藥物靶向傳遞到腫瘤部位，以提高藥物局部濃度，降低藥物的毒性。如Yeh等采用Schiff堿將轉鐵蛋白與抗腫瘤藥物阿霉素結合，實驗結果證明此藥物傳遞系統可靶向性殺死白血病腫瘤細胞而對正常血細胞無毒性[5]。還有一些研究者將轉鐵蛋白作為脂質體給藥系統的“導向基團”，實驗結果表明該系統能減少藥物的副作用，延長藥物在腫瘤部位的滯留時間[6]。

隨著分子影像學在腫瘤臨床醫學上的快速發展，眾多新型分子影像技術被研發出來，其中最引人注目的是利用熒光標記技術制備出不同探針應用于腫瘤的早期診斷[7]，監測體內分子的行為，成像運用的范圍從細胞、組織發展到全身水平。熒光染料的種類繁多，常用的熒光染料有異硫氰酸熒光素(FITC)、羥基熒光素(FAM)、四氯熒光素(TET)等，本實驗選用FITC作為標記靶向抗腫瘤藥物傳遞系統的熒光染料，為進一步研究藥物傳遞系統在體內的代謝途徑提供實驗平臺。

本實驗以轉鐵蛋白配體作為藥物傳遞系統“導向基團”，用精氨酸連接轉鐵蛋白與紫杉醇，并用熒光染料FITC標記紫杉醇前藥，制備熒光標記的靶向抗腫瘤藥物傳遞系統。采用TLC在反應過程中示蹤，LC-MS分子量鑒定，用紫外分光光度法初步鑒定此藥物傳遞系統的合成，用SDS電泳法證明其結構的組成，使用LPSA研究轉鐵蛋白修飾前與修飾后粒徑大小的變化，為下一步的細胞和動物實驗打下基礎。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

血清轉鐵蛋白、紫杉醇、精氨酸、熒光染料FITC購買于sigma公司。ZS-紫外分析攝影儀器180(中國遠明公司)，Lambda 35型紫外分光光度儀(上海分析儀器廠)，Zetasizer 3000HSA激光粒度儀(英國馬爾文儀器有限公司)

1.2 精氨酸-紫杉醇(Arg-PTX)的合成

稱取100 mg(0.117 mmol)PTX溶于15 mL的DCM，同時加入113.9 mg (0.140 4 mmol)Fmoc-Arg(pbf)-OH和14.29 mg DMAP(0.117mmol)，將44.85 mg(0.234 mmol,2 eqv)EDC溶于10mL DCM中，在冰浴條件下，將10 mL的EDC溶液緩慢滴入PTX反應體系中，大約25 min滴加完畢，除去冰浴，室溫下攪拌22 h。待反應完后，用同體積的DCM稀釋，然后用同體積的蒸餾水洗2次，加入無水硫酸鎂干燥，真空旋蒸后得晶狀體產物精氨酸-紫杉醇，其結構用LC-MS進行分子量鑒定。

1.3 FITC-精氨酸-紫杉醇(FITC-Arg-PTX)的制備

將精氨酸-紫杉醇溶于DMF中，加入0.01 mmol FITC, -4℃攪拌3h，將反應液經G25純化，得到純化的FITC-精氨酸-紫杉醇，用TLC鑒定。

1.4 轉鐵蛋白-FITC-精氨酸-紫杉醇藥物傳遞系統(Tf-FITC-Arg-PTX)的制備

先活化FITC-精氨酸-紫杉醇的羧基，加入DCC和NHS(摩爾比 FA∶DCC∶NHS = 1∶1.2∶2)，避光50℃攪拌6 h，反應結束，反應液減壓濾過副產物DCU。取上清液，用4倍的丙酮萃取活化的FITC-精氨酸-紫杉醇。然后將活化后的FITC-精氨酸-紫杉醇溶于2mL Tris緩沖液(10 mM，pH8.0)，并加入1 mL含24 mg Tf的Tris溶液，-4℃攪拌6 h，將反應液經G15純化，去除沒有共價偶聯的Tf和FITC-精氨酸-紫杉醇片段，得到純化的轉鐵蛋白-FITC-精氨酸-紫杉醇藥物傳遞系統，-20℃儲存備用。

1.5 轉鐵蛋白-FITC-精氨酸-紫杉醇藥物傳遞系統(Tf-FITC-Arg-PTX)的表征

1.5.1 轉鐵蛋白-FITC-精氨酸-紫杉醇藥物傳遞系統(Tf-FITC-Arg-PTX)的紫外吸收光譜分析

用紫外吸收光譜對合成的轉鐵蛋白-FITC-精氨酸-紫杉醇藥物傳遞系統進行初步表征， Tf、FITC、Arg和PTX的紫外吸收峰分別在260、347、220和227 nm處。用SDS-PAGE進一步考察轉鐵蛋白-FITC-精氨酸-紫杉醇藥物傳遞系統共價偶聯的結構特征。

1.5.2 轉鐵蛋白-FITC-精氨酸-紫杉醇藥物傳遞系統(Tf-FITC-Arg-PTX)粒徑大小的測定

轉鐵蛋白-FITC-精氨酸-紫杉醇藥物傳遞系統的粒徑及分布情況，可通過馬爾文粒度儀來測定，儀器測定的光源為He激光，檢測波長為633 nm，檢測角度為90°，粒徑測定范圍為2 nm～3 μm。

2 結果與討論

2.1 精氨酸-紫杉醇前藥(Arg-PTX)結構鑒定

純化后的-NH2-Arg(pbf)-PTX用LC-MS分析，其質譜鑒定的結果與NH2-Arg(pbf)-PTX的理論分子完全一致，-NH2-Arg(pbf)-PTX:MS (ESI,m/z):1285.4([M+Na]+)，如圖1。證明已成功合成精氨酸-紫杉醇前藥。

圖1 精氨酸-紫杉醇前藥用LC-MS的結構鑒定

2.2 FITC-精氨酸-紫杉醇(FITC-Arg-PTX)結構鑒定

圖2顯示，無論是在日光下還在熒光下,Arg-PTX和FITC-Arg-PTX在展開劑乙酸乙酯石∶油醚=3∶1時,所跑出點位置有明顯的區別，這是由于Arg-PTX的-NH2與FITC-Arg-PTX結構中酰胺鍵極性不同所致，由此可證明FITC-Arg-PTX前藥已成功的合成。在熒光下可以清晰地看到FITC-Arg-PTX前藥中由標記物FITC發出的熒光，證明Arg-PTX已成功標記FITC。

圖2 在日光和熒光下FITC-Arg-PTX前藥TLC

2.3 轉鐵蛋白-FITC-精氨酸-紫杉醇藥物傳遞系統(Tf-FITC-Arg-PTX)的紫外光譜和電泳圖

純化后Tf-FITC-Arg-PTX藥物傳遞系統的結構用紫外吸收光譜進行初步鑒定。將純化的Tf-FITC-Arg-PTX分別取一定的量溶于Tris buffer pH 8.0中，并用Tris buffer pH 8.0作為空白校正基線，從Tf-FITC-Arg-PTX化合物的紫外吸收光譜可以看到相應Tf、Arg、FITC和PTX的紫外吸收峰值分別在260、220、347和227 nm處,如圖3(A)所示,實驗結果表明成功地制備Tf-FITC-Arg-PTX藥物傳遞系統。用純化后的Tf-FITC-Arg-PTX化合物進行SDS-PAGE，以Tf作為Marker，跑出的Tf和Tf-FITC-Arg-PTX兩個電泳條帶在同一條直線上，說明用FITC-Arg-PTX修飾Tf，并沒有影響Tf的分子量，這是因為Tf的分子量有76.5kD，FITC-Arg-PTX的分子量與其相比可以忽略不計。將SDS-PAGE電泳條帶放在熒光下，可以看到FITC的熒光，進一步地證明FITC-Arg-PTX與Tf成功地共價偶聯，如圖3(B)所示。

圖3 表征Tf-FITC-Arg-PTX化合物

2.4 轉鐵蛋白-FITC-精氨酸-紫杉醇藥物傳遞系統(Tf-FITC-Arg-PTX)粒徑的特征

對轉鐵蛋白-FITC-精氨酸-紫杉醇藥物傳遞系統修飾之后粒徑變化的考察，主要是通過LPSA來衡量。Tf和Tf-FITC-Arg-PTX化合物的粒徑分布經馬爾文粒度儀測定，分別是(4.3±1.7)nm和(4.2±1.3)nm，表明兩種蛋白顆粒的粒徑沒有差異，說明化學修飾法對Tf蛋白粒徑大小沒有影響。

3 結 論

本實驗制備轉鐵蛋白-FITC-精氨酸-紫杉醇藥物傳遞系統，并用熒光染料FITC標記紫杉醇藥物傳遞系統，為下一步細胞和動物實驗提供實驗平臺。實驗結果顯示已成功地合成紫杉醇靶向藥物傳遞系統。

[1]Ten Tije AJ, Verweij J, Loos WJ, et al. Pharmacological effects of formulation vehicles:implications for cancer chemotherapy[J]. Clin Pharmacokinet,2013,42:665-685

[2]Sahoo SK,labhasetwar V.Enhanced Antiproliferative Activity of Transferrin-Conjugated Paclitaxel-Loaded Nanoparticles Is Mediated via Sustained Intracellular Drug Retention[J]. Mol Pharm, 2012,6:373-383

[3]Bicamumpaka C, PagéIn M. In vitro cytotoxicity of paclitaxel-transferrin conjugate on H69 cells[J].Oncol Rep,1998,5:1381-1384

[4]張莉，徐維平，蘇育德，等.轉鐵蛋白-轉鐵蛋白受體在腫瘤主動靶向治療中的應用[J].中國藥業,2012(5):56-58

[5]Yeh C-JG, Faulk WP. Killing of human tumor cells in culture with adriamycin conjugates of human transferring[J]. Clin Immunol Immunopathol, 1984, 32:1-11

[6]Lin Wu,Jinhui Wu,Yuanyuan Zhou,et al.Enhanced antitumor efficacy of cisplatin by tirapazamine-transferrin conjugate[J].Int J Pharm, 2012,15:2253-2268

[7]張琳華,何穎娜,馬桂蕾.葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡的制備及其抗腫瘤活性研究[J].中國藥學雜志，2010,45(22):1742-1748

(責任編輯：汪材印)

2014-10-12

安徽省自然科學基金項目(1308085MH136)；安徽省教育廳自然科學重點研究項目(KJ2014A249，KJ2013A242)

單玲玲(1971-)，女，安徽宿州人，博士，副教授，主要研究方向：腫瘤靶向探針及藥物的合成。

10.3969/j.issn.1673-2006.2014.12.025

R914.2

A

1673-2006(2014)12-0085-03