應用real—timePCR定量檢測土壤中小麥紋枯病菌方法的建立

徐娜娜　李鵬昌　于金鳳

摘要：根據小麥紋枯病菌Rhizoctonia cerealis AG-D融合群ITS區的DNA序列設計特異性引物對WKF-8/WKR-8， 對引物的特異性和靈敏性進行檢測，建立并優化基于SYBR GreenⅠ熒光染料法的real-time PCR 反應體系，繪制標準曲線。檢測范圍在1.0×10-3～10 ng/μl之間有良好的線性關系，相關系數R2為0.995，擴增效率為99.7%，靈敏度比常規PCR 方法高100倍。結果表明，該方法具有快速、特異性強、敏感度高等特點。

關鍵詞：小麥紋枯病菌；SYBR GreenⅠ熒光染色法；real-time PCR

中圖分類號：S435.12：Q785 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2014）03-0106-04

AbstractA pair of specific primers， WKF-8/WKR-8， were designed according to the DNA sequence of the internal transcribed spacers （ITS） region of Rhizoctonia cerealis AG-D fusion group. Their specificity and sensitivity were detected. A real-time polymerase chain reaction system was developed and optimized based on SYBR GreenⅠfluorescent staining method. And the standard curve was drawn. A good linear relationship between the template DNA amount and cycle threshold （Ct） value was observed in the range of 1.0×10-3～10 ng/μl. The correlation coefficient was 0.995， and the amplification efficiency was 99.7%. The sensitivity was 100 times higher than that of conventional PCR. The results showed that this method had characteristics of speediness， high sensitivity and specificity.

Key wordsRhizoctonia cerealis； SYBR Green Ⅰ fluorescent staining method； Real-time PCR

小麥在國家糧食安全和農業現代化發展中占有重要地位[1]。小麥紋枯病是世界范圍內嚴重發生的小麥病害之一。我國于1973年發現小麥紋枯病，近年來，隨著小麥品種、栽培制度、肥水條件等的改變，紋枯病發生危害逐漸加重，已成為影響小麥高產、穩產的重大障礙[2]。陳瑩、賈廷祥等的研究表明我國小麥紋枯病的優勢致病群為AG-D融合群[3，4]。綜合考慮和分析災害對小麥產量的影響是小麥生產災害診斷與預防的關鍵[5]。

目前對土壤中小麥紋枯病菌定量檢測的方法主要是傳統的活體分離、培養獲得菌株或者使用土壤浸出液涂板，促使土壤中的病原菌形成肉眼可見的單菌落，從而估計出土壤中禾谷絲核菌的量。傳統檢測方法受人為影響大，可重復性低，難以實現標準化檢測。近年來分子生物學的快速發展使得對病害的早期快速檢測成為可能，并開始應用于紋枯病菌的早期診斷。張廷婷[6]于2012年采用熒光定量PCR 技術檢測了花生種皮抗黃曲霉基因表達強度。Lees等[7]采用real-time PCR的方法，利用特異性引物對土壤中馬鈴薯黑痣病菌AG-3融合群進行了定量檢測。Sayler和Yang[8]也從感病水稻植株上，定量檢測了水稻紋枯病菌AG1-IA融合群。方正[9]用兩對特異性引物從感染小麥紋枯病菌的植株莖基部DNA中擴增到了約480 bp的特異性分子片段，可用于對小麥紋枯病的早期快速診斷和對病害的監測和預測預報。

本研究通過比較普通PCR和real-time PCR方法在檢測小麥紋枯病方面的優缺點，試圖建立土壤中小麥紋枯病菌的real-time PCR方法，以定量測定土壤中小麥紋枯病菌自然潛育狀態下的侵染量，為該病害的早期預測和防治措施的制定提供依據。

1材料與方法

1.1供試材料

小麥紋枯病菌相關菌株分離于山東農業大學小麥試驗基地罹病組織，玉米紋枯病菌、棉花立枯病菌、馬鈴薯黑痣病菌、鐮刀菌、蠕孢菌菌株由本實驗室提供。

1.2菌株DNA的提取與標準品制備

挑取目的菌株菌絲塊于附有滅菌玻璃紙的PDA培養基培養7 d，刮取菌絲，采用CTAB法[10]提取小麥紋枯病菌、玉米紋枯病菌、棉花立枯病菌、馬鈴薯黑痣病菌以及引起小麥莖基腐病的鐮刀菌和蠕孢菌的DNA。以小麥紋枯病菌WK-206菌株的DNA為標準樣品進行梯度稀釋（1.0×10-6～1.0×102 ng/μl）。

1.3引物設計合成

小麥紋枯病菌DNA經克隆測序，獲得ITS區序列。基于ITS區序列，利用引物設計軟件DNAman和Primer 5設計小麥紋枯病菌的特異性引物對WKF-8/WKR-8，由上海生工生物工程有限公司合成，并通過常規PCR和real-time PCR對引物的特異性進行檢測。

目前，對于土壤中小麥紋枯病菌的研究方法主要是微生物純培養法，獲得病原菌群落豐富的多樣性。然而隨著人們對土壤中微生物的原位生存狀態研究，發現常規分離培養方法難以實現病原菌的動態監測[13]。新興的實時熒光定量PCR 技術可以同時對多個樣品進行分析檢測，具有操作簡便、快速高效，且高度敏感性等特點[14]，因此適合于檢測環境中微生物在時間和空間上的動態變化。endprint

本研究根據real-time PCR的特點，基于ITS區設計了一對針對小麥紋枯病菌的特異性引物，特異性檢測結果良好，使用最優化的real-time PCR體系建立標準曲線，檢測待測樣品。標準曲線的決定系數R2為0.995，完全適用于對該菌的定量檢測，最低檢測下限是1.0×10-5 ng/μl，比常規PCR高出100倍，結果穩定可靠。該方法特異性強、靈敏度高、檢測迅速，能很好地用于土壤中小麥紋枯病菌的定量檢測，對掌握病害發生發展及流行以及指導病害預測預報具有重要意義。

參考文獻：

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[14]陳旭， 齊鳳坤， 康立功，等. 實時熒光定量PCR技術研究進展及其應用[J]. 東北農業大學學報， 2010， 41（8）：148-155.endprint

本研究根據real-time PCR的特點，基于ITS區設計了一對針對小麥紋枯病菌的特異性引物，特異性檢測結果良好，使用最優化的real-time PCR體系建立標準曲線，檢測待測樣品。標準曲線的決定系數R2為0.995，完全適用于對該菌的定量檢測，最低檢測下限是1.0×10-5 ng/μl，比常規PCR高出100倍，結果穩定可靠。該方法特異性強、靈敏度高、檢測迅速，能很好地用于土壤中小麥紋枯病菌的定量檢測，對掌握病害發生發展及流行以及指導病害預測預報具有重要意義。

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