乏氧條件下miR—29a通過AMPK調控胰島β細胞功能的研究

王秀娟　孫堯

【摘要】 目的：觀察乏氧條件下miRNA調節AMPK對胰腺β細胞發揮的作用。方法：經細胞培養及Real-time PCR，觀察在乏氧條件下miR-29a通過AMPK調控胰島β細胞功能的發揮。結果：INS-1細胞，主要表達AMPKα2，其磷酸化AMPK活性在乏氧條件下增加。用Real time PCR檢測AMPK的表達，發現乏氧說明在胰腺β細胞，主要表達AMPKα2亞基。乏氧能促進HIF-1α表達，促進AMPK的活化。同時AMPK可能受miR-29a的調節。結論：乏氧條件下胰島β細胞主要表達為AMPKa2，說明AMPK能促進胰島β細胞細胞增殖。

【關鍵詞】 AMPK； 胰腺β細胞； 乏氧； miR-29a

【Abstract】 Objective：To explore the mechanism by which miRNA plays roles in pancreatic β cells through regulating AMPK under hypoxic condition. Method：Under the condition of lack of oxygen miR - 29 a by AMPK regulation islet beta cell function were observed by cell culture and Real - time PCR.Result：The INS-1 cell primarily expressed AMPKα2， which the phosphorylation activity of AMPK was increased under hypoxic condition. the expression of AMPK was detected by Real time PCR， which suggested that pancreatic β cells primarily expressed AMPKα2 under hypoxic condition. Hypoxia could accelerate the expression of HIF-1α and the activation of AMPK. Meanwhile， AMPK might be regulated by miR-29a.Conclusion：Under the condition of lack of oxygen islet beta cells mainly expressed as AMPKa2， AMPK can promote cell proliferation islet beta cells.

【Key words】 AMPK； Pancreatic β cells； Hypoxia； miR-29a

First-authors address：Hebei United University，Tangshan 063000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.18.023

胰腺是一腺體器官，內分泌胰腺包括胰島，約有100～1000激素分泌細胞散布在外分泌組織和通過血管團相互聯系。胰島的功能主要是通過產生多種激素維持代謝平衡，這些激素調節血糖水平。胰腺β細胞的功能受很多分子的調控包括信號轉導通路、各種代謝分子及microRNA（miRNA）等構成一個復雜的網絡系統，精確調控其行為[1-3]。miRNA是一種內源性的非編碼RNA，廣泛存在于真核生物中。而乏氧上調miR-29a通過AMPK抑制胰腺β細胞增殖、促進凋亡及促進自噬。筆者采用分子生物學和細胞生物學的方法研究特分析如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 RPMI 1640培養液 RPMI 1640培養基干粉為Invitrogen產品，去離子水配制，每升加入2.0 g的碳酸氫鈉，充分溶解后用HCl調pH至7.4，0.22 μm濾膜過濾后4 ℃保存使用。

1.1.2 DMEM培養液 DMEM培養基干粉為Invitrogen 產品。去離子水配制，每升加入3.7 g的碳酸氫鈉，充分溶解后用HCl調pH至7.4，0.22 μm濾膜過濾后4 ℃保存使用。

1.1.3 D-Hanks液配制 1 L含有0.12 g Na2HPO4·7H2O，0.06 g KH2PO4，0.35 g NaHCO3，0.4 g KCl，8 g NaCl。

1.1.4 0.25%胰蛋白酶 1L D-Hanks液（pH 7.4）含有2.5 g胰酶，充分溶解后過濾除菌于4 ℃保存。

1.1.5 其他材料 細胞培養用各式培養皿、培養板和其他耗材，均購自Corning公司。

1.1.6 10×PBS 室溫保存，使用時以水稀釋至1×PBS，調pH 7.4。

1.1.7 Real-time PCR相關試劑 Olig（dT）18、dNTP、逆轉錄酶和逆轉錄酶抑制劑購自Promega公司；2×SYBR Green PCR Master Mix（Takara公司，日本），此混合物中含有dNTP、MgCl2、Taq DNA多聚酶、抗Taq單克隆抗體和SYBR Green I、II等。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 INS-1細胞為本實驗室保存，培養在RPMI1640并含有2 mmol/L Gln，另外加100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素，1 mmol/L丙酮酸鈉，完全的培養基含有10%滅活的胎牛血清，培養37 ℃，5% CO2條件下[4-5]。乏氧處理的條件是1% O2。

1.2.2 Real-time PCR 使用Primer Premier software 5.0軟件設計引物，DNA序列由上海生物工程有限公司合成，Real-time PCR擴增程序為：熱啟動95 ℃ 3 min，然后95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s擴增40循環，最后0.5 ℃/s作融解曲線。使用Light Cycler軟件分析結果。目的基因與內參Ct值各自通過標準曲線轉換為濃度值，以各目的基因和GAPDH基因的濃度比值表示mRNA的相對水平[6-8]。endprint

2 結果

2.1 乏氧條件下胰島β細胞AMPK的表達情況 為研究乏氧條件下胰島β細胞AMPK的表達情況，將INS-1細胞放于常氧和乏氧（1% O2）條件下培養，觀察不同乏氧時間4、12和24 h的AMPK表達情況，結果發現在INS-1細胞，主要表達AMPKα2，其磷酸化AMPK活性在乏氧條件下增加（圖1）。用Real time PCR檢測AMPK的表達，發現乏氧說明在胰腺β細胞，主要表達AMPKα2亞基（圖2）。當HIF-1α被抑制后，磷酸化AMPK下降，同時AMPK也下降。說明乏氧能促進HIF-1α表達，促進AMPK的活化（圖3）。

2.2 miR-29a調節AMPK在胰島細胞的表達 AMPK在胰島細胞有很重要的作用，筆者用生物學軟件對調節AMPK的3UTR的miRNAs進行了預測，發現AMPK的3UTR區有miR-29a結合位點，說明AMPK可能受miR-29a的調節，因此構建了AMPK的3UTR的報告基因載體，證明了AMPK是miR-29a的靶基因（圖4）。將INS-1細胞在乏氧條件下培養發現，乏氧能下調miR-29a的表達（圖5）。

3 討論

AMPK在細胞內氧化應激是活性增加。ROS誘導激活AMPK被認為對許多藥物的有益效果是非常重要的。例如，已報道二甲雙胍通過線粒體衍生的RNS激活AMPK。在小鼠骨骼肌AMPK被活化，氧化應激和增強葡萄糖轉運，并不依賴于AMP或AMP/ATP比值的變化。同樣，在細胞培養條件下，缺氧誘導的AMPK活化依賴于線粒體ROS而AMP/ATP比值沒有顯著的變化[9]。過氧化氫已被觀察到，能夠強烈誘導活化AMPK。

線粒體尤其線粒體受損是細胞ROS產生的主要來源，線粒體損傷與許多慢性疾病有關如糖尿病，神經退行性疾病和癌癥。AMPK可通過幾個機制調節線粒體ROS的產生[10]。解偶聯蛋白是線粒體陰離子載體蛋白的大家庭成員，解偶聯蛋白促進線粒體膜上的陰離子轉移。UCP2在控制線粒體ROS生產中起著重要的作用是治療肥胖、糖尿病及衰老的潛在靶點[11]。研究表明，一個在氧化還原調控AMPK的作用機制是通過上調線粒體UCP2表達。例如，通過AICAR激活AMPK，或過表達組成性激活AMPK，抑制O2生產和降低酪氨酸硝化前列環素合酶在人臍靜脈內皮細胞在高糖處理[12]。AMPK參與NPY/刺鼠相關肽的作用。后者似乎是由于了UCP2表達的調控，導致神經元的調控線粒體ROS的產生。培養MIN6胰島瘤細胞。此外，在動物模型，發現激活AMPK導致胰島UCP2表達的增加，此結果與在β細胞缺失的細胞結果一致[13]。盡管這些研究結果，AMPK調節UCP2表達和功能的詳細的機制仍然不完全清楚。新研究表明，AMPK調節自噬從而調節線粒體ROS的產生。眾所周知的，受損的蛋白質和DNA的或不正常的線粒體可導致線粒體產生ROS增強[14]。因此，細胞有各種特定的機制來控制這些受損細胞器，這樣的機制之一就是細胞自噬，從細胞中消除不正常的線粒體是至關重要的[14]。自噬缺陷導致生產ROS；這是由自噬功能失調的細胞或動物的許多實驗結果的支持。例如，從agt7缺陷小鼠的骨骼肌細胞表現為線粒體呼吸和ROS水平增加[15]。

筆者的研究發現乏氧條件下胰島β細胞主要表達AMPKα2，而AMPKα1表達很低，說明AMPK在細胞的表達存在組織特異性。進一步的結果說明AMPK能促進胰島β細胞細胞增殖。

參考文獻

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（收稿日期：2014-04-21） （本文編輯：蔡元元）endprint

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