益腎蠲痹丸對腎虛證與脾虛證膠原誘導性關節(jié)炎大鼠的療效比較

肖 誠 ，趙宏艷 ，王 燕 ，劉梅潔 ，王少君 ，潘靜華 ，呂 誠 ，呂愛平 ，鞠大宏 ?

（1．中日友好醫(yī)院 臨床醫(yī)學研究所，北京 100029；2．中國中醫(yī)科學院 中醫(yī)基礎理論研究所，北京 100700；3．民航總醫(yī)院 病理科，北京 100123；4．中國中醫(yī)科學院 中醫(yī)臨床基礎醫(yī)學研究所，北京 100700）

辨證論治是中醫(yī)藥治病的優(yōu)勢所在，建立切實符合疾病發(fā)病內(nèi)在本質(zhì)的動物模型的制作方法，對中醫(yī)學的發(fā)展具有重要意義。類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種病因尚未明了的慢性全身性炎癥性疾病，以慢性、對稱性、多滑膜關節(jié)炎和關節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)，屬于自身免疫炎性疾病，屬中醫(yī)學“痹證”范疇。現(xiàn)代研究表明，腎虛和脾虛在RA的發(fā)展中有著重要的作用。因此我們課題組對腎虛證及脾虛證RA大鼠模型的造模方法進行了大量研究[1～6]。

基于對腎虛證及脾虛證RA模型的研究基礎，結合中醫(yī)辨證論治的基本診療思路，本實驗欲通過觀察益腎蠲痹丸對兩種證型膠原誘導性關節(jié)炎（collagen induced arthritis，CIA）大鼠膝關節(jié)骨破壞程度及對腎虛與脾虛狀態(tài)的影響，對前期制作的腎虛證及脾虛證CIA動物模型進行驗證，并從基礎研究方面對辨證論治有進一步的闡述。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

選用6周齡雌性SPF級SD大鼠114只，由中國藥品生物制品檢定所提供，動物許可證號：SCXK（京）2005-0004。在中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所清潔級動物室喂養(yǎng)，實驗動物室許可證號：SYXK（京）2005-0024。

1.1.2 主要試劑與儀器

牛Ⅱ型膠原、不完全弗氏佐劑、大鼠抗牛Ⅱ型膠原試劑盒：美國Chondrex公司產(chǎn)品，批號：100028、100106和121109；羥基脲：齊魯制藥有限公司，批號：810025LC；益腎蠲痹丸：江蘇正大清江制藥有限公司；大鼠皮質(zhì)酮試劑盒：德國DRG公司產(chǎn)品，批號：61k059；細胞增殖檢測試劑盒：美國 BioVision公司產(chǎn)品，批號：40501；FITC anti-rat CD3、PE anti-rat CD4、PerCP anti-rat CD8a： 美國BioLegend 公司產(chǎn)品， 批號：B126921，B124011，B134493；Leica DM6000B生物顯微鏡：德國Leica公司產(chǎn)品；Multiskan Mk3酶標儀、Wellwash 4 Mk2洗板機：美國Thermo公司；EPICS XL型流式細胞儀：美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理

大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為以下10組：正常對照組10只、假手術組10只、CIA對照組12只、CIA治療組12只、腎虛證（去勢法）CIA組11只、腎虛證（去勢法）CIA組治療組11只、腎虛證（羥基脲法）CIA組12只、腎虛證（羥基脲法）CIA治療組12只、脾虛證 （利血平法）CIA組12只、脾虛證（利血平法）CIA治療組12只。

CIA組、CIA治療組：按前期方法[1]進行造模，即取適量牛Ⅱ型膠原溶液（濃度為2mg/ml）逐滴加入至等容積的不完全弗氏佐劑中，冰浴中用勻漿器充分乳化，以滴入水中不擴散為度，取乳化后的混合物按0.2ml/只，于尾根部皮下注射。7d后按0.1ml/只，于尾根部皮下加強免疫一次。去勢CIA組、去勢CIA組治療組：按常規(guī)方法[7]做去勢手術，即摘除雙側(cè)卵巢，假手術組大鼠只摘除雙側(cè)卵巢附近的脂肪組織；術后28d，去勢CIA組再按上述方法進行CIA模型復制。羥基脲CIA組、羥基脲CIA治療組：大鼠給予羥基脲（375 mg/kg/d）灌胃[8，9]，灌胃 17d后，按上述方法進行 CIA模型復制。利血平CIA組、利血平CIA治療組：大鼠給予利血平（0.5mg/kg/d）腹腔注射[10]，14d 后，按上述方法進行CIA模型復制。

為了保證免疫條件的齊同性，各組均在同一時間免疫。即以免疫時間為基準點，在免疫前28d行去勢手術、免疫前17d灌服羥基脲、免疫前14 d腹腔注射利血平。Ⅱ型膠原免疫18d后，從每組篩選出10只關節(jié)炎指數(shù)≥1分大鼠，開始給藥。各治療組均灌胃給予益腎蠲痹丸（3.67g/kg/d）[6]，1次/d，連續(xù)4周，其余各組灌以等容積生理鹽水。

關節(jié)炎指數(shù)評分：參照5級評分法評價[11]，將2只后踝關節(jié)的病變程度累計積分，計算出關節(jié)炎指數(shù)。0分：無關節(jié)炎；1分：小趾關節(jié)輕度腫脹；2分：小趾關節(jié)和足跖腫脹；3分：踝關節(jié)以下的足爪腫脹；4分：包括踝關節(jié)在內(nèi)全部關節(jié)腫脹。

1.2.2 取材

戊巴比妥鈉麻醉下，采用腹主動脈取血，分別用于T淋巴細胞亞群的檢測及血漿的制備，取血后立即取出腎上腺稱重，制備的血漿及腎上腺于-80℃冰凍備用。取雙側(cè)膝關節(jié)，置于福爾馬林中固定備用。

1.2.3 指標的測定

（1）一般狀態(tài)觀察：觀測大鼠體重、被毛、活動及排便狀況等。

（2）關節(jié)切片及光鏡下關節(jié)破壞半定量分析方法：關節(jié)于5%HNO3脫鈣1周后，常規(guī)石蠟切片及HE染色。光鏡下觀察滑膜、軟骨、骨的病理改變，并進行關節(jié)病理損傷半定量分析[12]。0分：關節(jié)結構正常，關節(jié)間隙均勻，軟骨、骨無損傷，滑膜組織無炎癥、增生等；1分：關節(jié)結構基本正常，有滑膜增生，血管數(shù)量增加，可見少量炎細胞浸潤，軟骨表層輕度破壞；2分：關節(jié)軟骨有明顯的侵蝕破壞，血管翳形成，炎細胞浸潤明顯，無骨破壞，關節(jié)間隙基本正常；3分：有大量的血管翳形成，可見廣泛的軟骨的侵蝕破壞，可見骨破壞，關節(jié)結構遭破壞。

（3）血漿抗Ⅱ型膠原抗體、血漿皮質(zhì)酮（corticosterone，CORT）含量測定：均采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測，具體操作方法按試劑盒說明書進行。

（4）腎上腺環(huán)磷腺苷酸（cAMP）、環(huán)磷鳥苷酸（cGMP）含量測定： 取大鼠雙側(cè)腎上腺，稱重后，按說明書所示方法制備樣品，采用放射免疫法測定cAMP、cGMP含量。

（5）外周血T淋巴細胞亞群的檢測：分別用FITC、PE、PerCP 標記的抗大鼠 CD3+、CD4+、CD8+單抗，對全血中淋巴細胞進行免疫熒光染色，室溫下避光反應40min，加入紅細胞裂解液2ml，5min后加入 5ml D-Hank’s，350g離心 5min洗 2遍，加入500μl D-Hank’s，混勻后上流式細胞儀檢測。收集4000個細胞用于數(shù)據(jù)分析。

（6）脾淋巴細胞增殖的檢測：無菌取脾制成淋巴細胞懸液，用1640培養(yǎng)液調(diào)整脾細胞濃度為2×106/ml，取 50μl加入 96 孔板，每只動物脾細胞懸液平行設9個復孔，分為3組，即刀豆球蛋白A（ConA，10μg/ml）組、脂多糖（LPS，4μg/ml）組和正常對照組，每組3個復孔。然后分別加入ConA、LPS和 1640培養(yǎng)液各 50μl。于 37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h后，每孔加入10μl WST-1溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4h，于酶標儀中記錄吸光度（OD450nm/630nm）。細胞增殖反應以 ConA或LPS刺激指數(shù)表示，即實驗孔與對照孔吸光度的比值。

1.2.4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。

2 結果

2.1 益腎蠲痹丸對各組CIA大鼠行為學的影響

正常對照組與假手術組：大鼠精神狀態(tài)良好，被毛光澤，飲食正常，活動自如。

CIA組：大鼠精神狀態(tài)良好，被毛光澤，飲食正常，體重略有下降，踝關節(jié)紅腫，活動受限。

去勢CIA組：大鼠精神萎靡，弓背蜷縮，體毛枯疏，飲食正常，喜扎堆，踝關節(jié)紅腫，活動減少。

去勢CIA治療組：大鼠精神狀態(tài)良好，弓背蜷縮，體毛枯疏，飲食正常，扎堆現(xiàn)象減少，踝關節(jié)紅腫程度減輕，活動減少。

羥基脲CIA組：大鼠精神萎靡，弓背蜷縮，被毛無光澤，四肢發(fā)涼、發(fā)白，體溫下降，喜扎堆，飲食減少，肛周污穢，踝關節(jié)腫脹，懶動。

羥基脲CIA治療組：大鼠精神萎靡，弓背蜷縮，被毛無光澤，飲食尚可，體溫較羥基脲CIA組有所上升，喜扎堆現(xiàn)象略有減少，踝關節(jié)紅腫程度減輕，懶動。

利血平CIA組：大鼠精神萎靡，瞇眼，被毛枯疏無光澤，弓背蜷縮，踝關節(jié)紅腫，倦怠、懶動，喜聚堆，飲食減少，體重下降，便溏。

利血平CIA治療組：大鼠精神萎靡，瞇眼癥狀減輕，被毛枯疏無光澤，弓背蜷縮，踝關節(jié)紅腫略有減輕，倦怠、懶動，喜聚堆，體重下降，稀便。

2.2 益腎蠲痹丸對各組CIA大鼠膝關節(jié)病理損傷的影響

光鏡觀察結果顯示：正常對照組與假手術組：膝關節(jié)結構正常，關節(jié)軟骨表面光滑，軟骨基質(zhì)及軟骨細胞無退行性變，滑膜組織無增生，關節(jié)軟骨下骨小梁大小、排列未見異常。CIA對照組、羥基脲CIA組、去勢CIA組及利血平CIA組：關節(jié)腔內(nèi)可見程度不同的滑膜組織增生，血管翳形成，其內(nèi)見有擴張的血管、新生毛細血管及成纖維細胞，并伴有淋巴細胞浸潤。關節(jié)軟骨及軟骨下骨見不同程度的侵蝕破壞，關節(jié)結構破壞。CIA治療組、羥基脲CIA治療組、去勢CIA治療組和利血平CIA治療組：分別與相應模型組比較，滑膜細胞增生減輕，血管增生和浸潤炎細胞數(shù)量減少，血管翳形成減少，骨質(zhì)破壞有所減輕。

膝關節(jié)病理損傷積分結果表明：各組CIA大鼠膝關節(jié)病理積分顯著升高（P＜0.05）。與羥基脲CIA組相比，益腎蠲痹丸治療后大鼠膝關節(jié)病理積分顯著下降（P＜0.05）；與去勢CIA組相比，益腎蠲痹丸治療后大鼠膝關節(jié)病理積分亦顯著下降（P＜0.01）；與利血平CIA大鼠相比，益腎蠲痹丸治療后大鼠膝關節(jié)病理積分雖降低，但無統(tǒng)計學意義（見圖 1）。

2.3 益腎蠲痹丸對各組CIA大鼠血漿抗Ⅱ型膠原抗體的影響

與正常對照組相比，各CIA組及給藥組抗Ⅱ型膠原抗體含量顯著升高（P＜0.01）；與CIA對照組相比，去勢CIA組、羥基脲CIA組、利血平CIA組CⅡ含量顯著升高（P＜0.01）；益腎蠲痹丸能顯著下調(diào)各證型CIA大鼠抗Ⅱ型膠原抗體含量（P＜0.05，P＜0.01）（見表 1）。

2.4 益腎蠲痹丸對CIA大鼠腎虛指標的影響

2.4.1 益腎蠲痹丸對CIA大鼠血漿CORT含量的影響

CIA對照組CORT含量與正常對照組相比，無顯著性差異。與CIA對照組相比，去勢CIA組及羥基脲CIA組大鼠CORT顯著下降 （P＜0.05）；與去勢CIA組相比，去勢CIA治療組CORT顯著升高（P＜0.05）；羥基脲CIA治療組與羥基脲CIA組比較，無顯著性差異（見表2）。

2.4.2 益腎蠲痹丸對腎上腺cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP的影響

圖1 各組大鼠膝關節(jié)病理損傷積分（x±s，n=10）

CIA對照組 cAMP、cGMP和 cAMP/cGMP與正常對照組相比，無顯著性差異。與CIA對照組相比，去勢CIA及羥基脲CIA組cAMP含量顯著下降（P＜0.01，P＜0.05），去勢 CIA 組 cGMP 含量顯著升高（P＜0.05），羥基脲CIA組cGMP含量無顯著性改變，而去勢CIA組及羥基脲CIA組大鼠cAMP/cGMP均顯著下降（P＜0.01）。與羥基脲CIA組相比，治療后cAMP、cGMP及AMP/cGMP有升高趨勢，但均無統(tǒng)計學意義。與去勢CIA組相比，去勢CIA治療組cAMP/cGMP顯著升高（P＜0.01）（見表 2）。

2.5益腎蠲痹丸對CIA大鼠脾虛指標的影響

2.5.1益腎蠲痹丸外周血T淋巴細胞亞群測定

CIA對照組大鼠外周血中CD3+細胞、CD4+細胞、CD8+細胞百分比與正常對照組相比，無顯著性差異，但 CD4/CD8顯著升高（P＜0.05）。 與 CIA對照組相比，利血平CIA組CD3+細胞、CD4+細胞百分比顯著下降 （P＜0.05），CD8+細胞百分比和CD4/CD8無顯著變化。益腎蠲痹丸治療前后，利血平CIA大鼠CD4/CD8亦無顯著性差異 （見表3）。

2.5.2 脾臟淋巴細胞增殖的檢測

表1 各組大鼠血漿抗Ⅱ型膠原抗體水平（n=10）

表2 各組大鼠血漿CORT、腎上腺cAMP、cGMP與cAMP/cGMP的變化（n=10）

表3 各組大鼠外周血T淋巴細胞亞群變化（n=10）

表4各組大鼠脾臟淋巴細胞刺激指數(shù)的變化（n=10）

與正常對照組相比，CIA對照組ConA刺激后的T細胞增殖能力和LPS刺激后B細胞增殖能力顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）。 與 CIA 對照組相比，利血平CIA組大鼠T細胞增殖能力顯著下降（P＜0.05），B細胞增殖能力亦顯著下降，但無統(tǒng)計學意義。CIA治療組T細胞和B細胞增殖能力，較 CIA 對照組顯著降低 （P＜0.01，P＜0.05）。與利血平CIA組相比，利血平CIA治療組T細胞增殖能力顯著降低 （P＜0.05），B細胞增殖能力無顯著性差異（見表4）。

3 討論

RA屬中醫(yī)學“痹病”的范疇，本病的病因病機是正氣虧虛，營衛(wèi)不和，邪氣趁虛而入，流注筋骨，搏結關節(jié)，而發(fā)為痹痛。中醫(yī)專家朱良春根據(jù)多年的臨床經(jīng)驗，認為本病病變在骨，骨為腎所主，故應益腎壯督治其本，蠲痹通絡治其標，從而研制出益腎蠲痹丸。益腎蠲痹丸是具有蠲痹通絡，搜剔病邪的作用，諸藥相合，達到溫補腎陽、益腎壯督、搜風剔邪、蠲痹通絡之功效[12]。因此選用該藥作為本實驗補腎除痹的代表藥物，從以方測證的角度觀察該藥對單純痹癥、腎虛痹癥及脾虛痹癥的療效，為RA病證結合動物模型的制作提供進一步的評判依據(jù)。

根據(jù)前期研究，制備了腎虛證與脾虛證CIA大鼠模型[3，4]。經(jīng)益腎蠲痹丸治療后，各組大鼠膝關節(jié)損傷均有不同程度的改善，但CIA對照組及脾虛證CIA大鼠關節(jié)改善程度差于腎虛證CIA大鼠；對2種腎虛證CIA關節(jié)損傷療效分析發(fā)現(xiàn)，益腎蠲痹丸對去勢法制作的腎虛CIA大鼠關節(jié)損傷優(yōu)于羥基脲法制作的腎虛CIA大鼠。抗Ⅱ型膠原自身抗體水平的高低，可反映機體炎癥的嚴重程度[13，14]。對抗Ⅱ型膠原抗體檢測顯示，去勢CIA組大鼠、羥基脲CIA組大鼠、利血平CIA組大鼠血漿抗Ⅱ型膠原抗體含量與CIA對照組大鼠相比顯著升高，說明腎虛與脾虛證候可加重CIA的發(fā)病程度；經(jīng)益腎蠲痹丸治療后，CIA對照組大鼠及不同證型CIA組大鼠抗Ⅱ型膠原抗體水平均有不同程度的下降，其中腎虛CIA大鼠下降最明顯，脾虛CIA大鼠其次，CIA對照組再次。進一步反映益腎蠲痹丸對腎虛證CIA大鼠療效最為明顯。

“下丘腦-垂體-靶腺”軸不同環(huán)節(jié)、不同程度的功能紊亂是腎虛證的主要病理基礎。糖皮質(zhì)激素（人類主要為皮質(zhì)醇，大鼠主要為CORT）是下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）軸終末激素。CORT是腎上腺在應激反應里產(chǎn)生的一種類激素，腎虛證患者腎上腺皮質(zhì)功能低下，血漿CORT含量降低是診斷腎上腺皮質(zhì)功能減退的直接證據(jù)[15]；cAMP是核苷酸的衍生物，為蛋白激酶致活劑，是有機體中廣泛存在的一種具有生理活性的重要物質(zhì)，cGMP跟cAMP一樣，是一種具有細胞內(nèi)信息傳遞作用的第二信使，其生物效應和 cAMP相反。cAMP和cGMP是一對相互拮抗又相互制約的物質(zhì)，對于細胞功能處于穩(wěn)定狀態(tài)具有雙向調(diào)節(jié)作用。目前已有研究通過檢測cAMP/cGMP來探討腎虛的本質(zhì)[16，17]。實驗研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)益腎蠲痹丸治療后，去勢CIA大鼠腎上腺CAMP/cGMP顯著升高，而羥基脲CIA大鼠腎上腺cAMP/cGMP雖升高，但無統(tǒng)計學意義。經(jīng)益腎蠲痹丸治療后，去勢CIA大鼠血漿CORT顯著升高，羥基脲CIA大鼠血漿CORT有升高的趨勢。說明益腎蠲痹丸對去勢法制作的腎虛狀態(tài)具有更好的調(diào)節(jié)作用。

T淋巴細胞是細胞免疫的主要效應細胞，也是機體免疫應答的主要調(diào)節(jié)細胞。用單抗測定外周血白細胞中CD4和CD8陽性細胞百分比，或是兩種細胞的比值，來初步評估機體免疫狀態(tài)。有研究表明[18～20]：脾虛證患者出現(xiàn) CD3+、CD4+T細胞數(shù)量及CD4/CD8比值的下降，T細胞亞群的平衡狀態(tài)失調(diào)，這與脾氣虛弱致抗御外邪的機能降低相一致。T淋巴細胞、B淋巴細胞表面具有絲裂原受體，受非特異性絲裂原（如ConA和LPS）刺激后能分裂增殖，轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞。根據(jù)淋巴細胞轉(zhuǎn)化率可判斷機體的細胞免疫水平和體液免疫水平。研究結果顯示，利血平制作的脾虛模型T、B淋巴細胞增殖能力降低。經(jīng)益腎蠲痹丸治療后，脾虛CIA大鼠T、B淋巴細胞增殖能力下降，CD4/CD8亦下降，但并無統(tǒng)計學意義，說明益腎蠲痹丸對利血平制作的CIA大鼠的脾虛功能調(diào)整作用有限。

益腎蠲痹丸對腎虛證CIA大鼠的療效要優(yōu)于脾虛證CIA大鼠及CIA對照組大鼠，而去勢所致腎虛CIA大鼠療效要略優(yōu)于羥基脲所致腎虛CIA大鼠，表明去勢法制作的腎虛證CIA模型可能更符合中醫(yī)的腎虛證候動物模型。同時益腎蠲痹丸對腎虛狀態(tài)有較好的調(diào)節(jié)作用，尤其是去勢法所致的腎虛CIA大鼠的調(diào)節(jié)作用更為顯著，對利血平所致的脾虛功能調(diào)整作用有限，以上結果亦為中醫(yī)辨證治療的合理性提供了實驗依據(jù)。

[1]趙宏艷，王燕，肖誠，等．不同品系、不同性別對大鼠CIA發(fā)病情況的比較研究 [J]．中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2010，16（9）：761-764.

[2]鞠大宏，趙宏艷，王燕，等．不同時間去勢對大鼠CIA發(fā)病情況的影響[J]．中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2010，16（8）：658-661.

[3]王燕，趙宏艷，劉梅潔，等．類風濕關節(jié)炎腎虛證大鼠模型的建立[J]．中西醫(yī)結合學報，2011，9（9）：973-982．

[4]杜中平，趙宏艷，肖誠，等．類風濕性關節(jié)炎脾虛證病證結合動物模型的建立[J]．世界科學技術（中醫(yī)藥現(xiàn)代化），2012，14（2）：1384-1392．

[5]趙宏艷，王燕，于崢，等．益腎蠲痹丸對腎虛證與脾虛證CIA大鼠免疫因子的調(diào)節(jié)作用研究[J]．中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2013，19（3）：261-263.

[6]Hongyan Zhao，Jian Li，Xiaojuan He，et al.The protective effect of Yi Shen Juan Bi Pill in arthritic rats with Castration-induced kidney deficiency[J].Evidence-based Complementaryand AlternativeMedicine，2012，doi：10.1155/2012/102641

[7]鞠大宏，于福祿，張麗坤，等．滋陰補腎法對卵巢切除所致骨質(zhì)疏松大鼠成骨細胞COX-2蛋白和mRNA表達的影響[J]．中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2006，12（12）：918-920．

[8]鄒移海，徐志偉，張薇，等.腎陽虛證動物模型造模方法和評價指標規(guī)范化研究[A].亞洲實驗動物學會聯(lián)合會（AFLAS）、中國實驗動物學會 （CALAS）.亞洲實驗動物學會聯(lián)合會（AFLAS）第三次會議暨中國實驗動物學會（CALAS）第八屆學術年會論文集[C].亞洲實驗動物學會聯(lián)合會（AFLAS）、中國實驗動物學會（CALAS），2008.2.

[9]段宏莉.羥基脲制作SD大鼠腎陽虛證模型的規(guī)范化研究[D].廣州中醫(yī)藥大學，2005.

[10]趙寧，賈紅偉，張皖東，等．利血平所致脾虛大鼠脾陽虛證和脾氣虛證的證候?qū)傩訹J]．中醫(yī)雜志，2008，49（5）：449-452．

[11]Holmdahl R，Jansson L，Andersson M，et al．Immunogenetics of typeⅡ collagen autoimmunity and susceptibility to collagen arthritis[J]．Immunology，1988， 65（2）：305．

[12]張文康，朱良春.中國百年百名中醫(yī)臨床專家叢書[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2001.184-237.

[13]Qiang Z，Xia L，Zhanguo L，et al.The type II collagen specific T cell response and antibody in rheumatoid arthritis and their relation to HLA-DR4[J].Nat Med J China，2005，85：370-373.

[14]Holmdahl R，Jansson L，Larsson A，et al.Arthritis in DBA/1 mice induced with passively transferred type II collagen immune serum[J].Scand J Immunol，1990，31（2）：147-157.

[15]李琦，周佩云，李浩，等.更年期綜合征中醫(yī)腎虛證患者實驗室指標判別分析 [J].中國中西醫(yī)結合雜志，2013，33（8）：1064-1068.

[16]趙國青.強直性脊柱炎腎虛督寒證中醫(yī)療效評價量表的建立與評價[D].廣州中醫(yī)藥大學，2013.

[17]楊裕華，李震.腎陽虛動物模型及其診斷指標研究近況[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報，2007，9（5）：40-42.

[18]王克窮，王興華.益氣健脾法治療胃癌術后脾虛證臨床觀察[J].遼寧中醫(yī)雜志，2008，35（10）：1524-1525.

[19]陶拉娣，秦紹愛.扶正健脾方對脾虛厭食癥患兒微量元素含量及免疫功能的影響 [J].中國中西醫(yī)結合雜志，2002，22（6）：429-431.

[20]郎笑梅，王再謨.脾虛寧膠囊對脾虛泄瀉患者T細胞亞群的影響[J].安徽中醫(yī)臨床雜志，2002，14（6）：449-450.