Let-7b慢病毒載體構建及對大鼠骨髓間充質干細胞誘導分化為神經細胞的影響

張 靜 徐小隔 龔 哲 趙紹云 何 霞 王天舒 焦淑潔 滕軍放 賈延劼

鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052

·論著·

Let-7b慢病毒載體構建及對大鼠骨髓間充質干細胞誘導分化為神經細胞的影響

張 靜 徐小隔 龔 哲 趙紹云 何 霞 王天舒 焦淑潔 滕軍放 賈延劼

鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052

目的 探討Let-7b過表達和Let-7b抑制慢病毒載體在體外誘導大鼠骨髓間充質干細胞(MSCs)向神經細胞分化中的作用。方法 構建Let-7b過表達和Let-7b抑制慢病毒載體并感染大鼠MSCs，篩選最適感染復數(MOI)；實驗分未感染組、感染組1(感染LV-rno-Let-7b-up)、感染組2(感染LV-rno-Let-7b-inhibition)、陰性對照組(感染空病毒)；采用法舒地爾誘導感染后大鼠MSCs分化為神經元細胞。倒置熒光顯微鏡下觀察MSCs感染后熒光表達情況；采用免疫細胞化學染色檢測神經元烯醇化酶(NSE)、神經微管結合蛋白(MAP-2)的表達變化；PT-PCR檢測MAP-2 mRNA的表達變化；MTT法檢測細胞存活率。結果 倒置顯微鏡下觀察大鼠LV-rno-Let-7b-up和LV-rno-Let-7b-inhibition慢病毒載體感染成功，MOI值為10，感染3 d時大鼠LV-rno-Let-7b-up慢病毒感染率最高，細胞存活率較高，感染率可達(92.1±4.3)%；MOI為20，感染5 d時大鼠LV-rno-Let-7b-inhibition慢病毒感染率最高，細胞存活率較高，感染率可達(90.3±4.2)%。法舒地爾可以誘導MSCs向神經細胞分化，感染組1誘導MSCs為神經細胞顯著高于陰性對照組和感染組2，NSE、MAP-2表達率明顯高于陰性對照組和感染組，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 結論 LV-rno-Let-7b-up可更高效感染大鼠 MSCs，感染LV-rno-Let-7b-up后大鼠MSCs經法舒地爾誘導向神經細胞分化比率增加。

Let-7b；骨髓間充質干細胞；神經元

骨髓間充質干細胞(marrow mesenchymal stem cell，MSCs)是骨髓中除造血干細胞外的另一類具有高度可塑性的細胞群體，是一類可以從體內器官組織中分離出的具備在體外培養、誘導和擴增等特性的細胞[1]，在基因治療、細胞治療、組織工程等領域具有廣泛的臨床應用前景[2]。MicroRNAs(miRNAs)是真核生物內發現的一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA，長20～25個核苷酸，可通過轉錄水平、轉錄后水平、表觀遺傳學水平和異染色質形成等方式調控基因組的表達，參與 MSCs重要的生物學進程，包括增殖、分化、信號轉導、死亡等[3-5]，miRNAs幾乎參與所有動物的發展和病理過程，miRNA的生物合成是受嚴格的時間和空間的控制，其失調與許多人類疾病有關[6]。誘導MSCs分化為神經細胞可能為中樞神經系統疾病的治療提供可行性方法[7]。lin28/let-7這對搭檔分子被認為是經典的發育調節子,主要調控干細胞增殖、分化、衰老及細胞重編程等多個環節[8-9]。Let-7b為let-7家族中的一員，其在MSCs分化為神經細胞過程的作用機制尚不清楚。本研究根據確定的Let-7b序列分別構建目的microRNA過表達和抑制慢病毒載體，法舒地爾誘導各組細胞，觀察Let-7b在大鼠MSCs橫向分化為神經細胞中的作用。

1 材料和方法

1.1 動物 SPF級別SD大鼠，雌雄不限，6～8周齡，體質量100～120 g，由河南省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(豫)2010-0002。MSCs由大鼠股骨及脛骨中分離提取，連續傳10代以上。

1.2 主要試劑 Age I、EcoR I和T4 DNA ligase購自NEB；病毒包裝三質粒:GV重組載體系列(同時可表達綠色熒光蛋白)和pHelper 1.0和pHelper 2.0均購自上海吉凱基因化學有限公司。DMEM液體培養基和胎牛血清購自Gibco；神經元烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE，bs-1027R)、神經微管結合蛋白( microtubulin-associated protein 2，MAP-2，bs-1368R)兔抗多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；Cy3標記山羊抗兔IgG(H+L)購自上海碧云天公司；RNA提取試劑盒購自康為，RT-PCR試劑盒均為Oligo產品；凝聚胺多聚賴氨酸和噻唑藍( MTT) 購自Sigma；其他生化試劑均為進口分裝或國產分析純化，所用引物由廣州銳博技術有限公司根據設計合成。

1.3 主要方法

1.3.1 microRNA Let-7b過表達和抑制慢病毒載體構建： 根據miRBase數據庫獲得Let-7b(MIMAT0000775)過表達和抑制的序列，設計合適的引物序列，PCR方法合成雙鏈DNA oligo，其兩端含酶切位點黏端。將GV159載體經Age I和EcoR I雙酶切后，在T4 DNA連接酶的作用下與雙聯DNA oligo于22℃連接3 h后轉化大腸桿菌感受態細胞后進行陽性克隆PCR鑒定。脂質體介導的瞬時感染的方法進行慢病毒顆粒的包裝。

轉染前24 h，用胰蛋白酶消化對數生長期的293T細胞，以含10%血清的培養基調整細胞密度為1.2×107細胞/20 mL，重新接種于15 cm細胞培養皿，37℃、5% CO2培養箱內培養。24 h待細胞密度達 70%～80%時即可用于轉染。轉染前2 h將細胞培養基更換為無血清培養基。向一滅菌離心管中加入所制備的各DNA溶液(pGC-LV 載體20 μg，pHelper 1.0載體15 μg，pHelper 2.0 載體10 μg)，與相應體積的Opti-MEM混合均勻，調整總體積為2.5 mL，在室溫下溫育5 min。將Lipofectamine 2000 試劑輕柔搖勻，取100 μL Lipofectamine 2000試劑在另一管中與2.4 mL Opti-MEM 混合，在室溫下溫育5 min。把稀釋后的DNA與稀釋后的Lipofectamine 2000 進行混合，輕輕地顛倒混勻，不要振蕩。必須在5 min內混合。混合后，在室溫下溫育20 min，以便形成DNA與Lipofectamine 2000 稀釋液的轉染復合物。將DNA與Lipofectamine 2000 混合液轉移至293T 細胞的培養液中，混勻，于37℃、5% CO2細胞培養箱中培養。培養8 h后倒去含有轉染混和物的培養基，每瓶細胞加入20 mL的PBS液，輕輕左右晃動一下培養瓶以洗滌殘余的轉染混和物，然后倒去。每瓶細胞中加入含10%血清的細胞培養基25 mL，于37℃、5% CO2培養箱內繼續培養48 h。

收集轉染后48 h的293T細胞上清液。于4℃、4000 g離心10 min，除去細胞碎片。以0.45 μm濾器過濾上清液于40 mL超速離心管中，再離心濃縮病毒液至所需濃度，收集病毒液，分裝后-80℃長期保存，取其中1支用孔稀釋法進行病毒滴度測定，同樣方法制備僅含EGFP報告基因的陰性對照慢病毒載體。

1.3.2 感染復數MOI(multiply of infection，MOI)值測定： 按照常規方法轉染慢病毒，并取不同的MOI值，感染后每天在倒置熒光顯微鏡下觀察各組細胞的EGFP表達情況，并計數EGFP陽性細胞的百分比。

1.3.3 大鼠MSCs感染及實驗分組： 取LV-rno-Let-7b-up和LV-rno-Let-7b-inhibition以最適合MOI值感染大鼠MSCs，同時取同一MOI值的空病毒感染陰性對照組置于37℃、5% CO2培養箱內孵育，孵育24～72 h。根據感染情況將同時點的MSCs分為4組：未感染：不進行感染，其他培養條件同各感染組；感染組1：感染LV-rno-Let-7b-up，即含Let-7b-up病毒和EGFP；感染組2：感染LV-rno-Let-7b-inhibition，即含Let-7b-inhibition病毒和EGFP；陰性對照組：感染空病毒，即只含有EGFP。在倒置顯微鏡下觀察感染24 h、48 h、72 h、96 h EGFP熒光表達情況，評價細胞感染效率。

1.3.4 體外誘導MSCs分化為神經細胞： 取各組細胞進行誘導實驗，棄DMEM完全培養基，PBS洗3次，加入預誘導液(DMEM+10%胎牛血清+200 μmol/L法舒地爾)置于37℃、5% CO2培養箱培養2 h。

1.3.5 MTT比色法： 將感染LV-rno-Let-7b-up、LV-rno-Let-7b-inhibition和空病毒前后各時點的MSCs移入96孔培養板，加入MTT(5.0 g/L)50 μL/well、置于培養箱孵育4 h，離心棄上清，加入二甲基亞砜200μL，采用酶聯免疫檢測儀測定各孔吸光度，評價細胞存活率。

1.3.6 免疫細胞化學染色法： 分別將各組細胞經過PBS、4%多聚甲醛、0.2% Triton X-100、封閉液處理后加入NSE抗體(1.0 mg/L)、MAP-2抗體(1.0 mg/L)4℃孵育24 h，之后再用PBS清洗后加入二抗染色標記。觀察細胞圖像通過顯微鏡用×10或×20攝取每組獨立的實驗都會采集超過30個區域的細胞，而且，在明視野下所采集的每幅圖像都盡量包含相同細胞數目，應用Image Pro Plus 6.0專業圖像分析軟件分析各實驗組熒光圖片單個細胞的累積吸光度值，進行統計學分析。

1.3.7 RT-PCR： 采用康為試劑盒分離純化各組細胞的總RNA，分光光度法測定計算提取的總RNA含量及濃度。參照oligo試劑盒實驗操作說明進行RT-PCR，總反應體積20 μL，然后取RT-PCR產物10.0 μL，加上樣緩沖液2.0 μL，在2%瓊脂糖凝膠上電泳，70 V 40 min，凝膠圖像成像系統拍攝保存實驗結果，凝膠圖像分析系統(GelProAnalyzer 3.0) 分析各目的基因與β-actin 基因條帶吸光度值。

2 結果

2.1 Let-7b過表達和抑制慢病毒載體的構建 GV159載體經Age I和EcoR I雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳顯示載體中位于兩酶切位點間的原有片段被分離，載體被切割成線性，挑選陽性克隆送測序，陽性克隆測序結果，證明大鼠Let-7b過表達和抑制慢病毒載體構建成功，慢病毒載體系統的3個質粒GV159、pHelper 1.0和pHelper 2.0按一定比例感染293T細胞，收集感染后48 h的293T細胞上清液，進行離心濃縮，取濃縮的病毒液用孔稀釋法進行病毒滴度測定，Let-7b過表達慢病毒載體T=3×103TU/L(TU，transduction unit)，Let-7b抑制慢病毒載體T=8×108TU/L。

2.2 Let-7b過表達和抑制慢病毒感染 本研究采用含有綠色熒光報告基因(EGFP)標記的病毒載體觀察、評估感染效率，倒置熒光顯微鏡觀察感染24 h，可以觀察到部分綠色熒光，Let-7b過表達慢病毒感染3 d時EGFP表達最理想(見圖1)，Let-7b抑制慢病毒感染5 d時EGFP表達最理想(見圖2)，感染組合陰性對照組EGFP感染率無顯著差異。

圖1 Let-7b過表達慢病毒載體熒光照片

圖2 Let-7b抑制慢病毒載體熒光照片

2.3 MTT結果 感染前各組MSCs的MTT結果無顯著差異(P>0.05)；感染24 h感染組MTT顯著下降，與各對照組MTT比較均有顯著差異(P<0.05)，各對照組之間無明顯差異。感染48 h、72 h、96 h后MTT值雖較24 h有所上升(P<0.05)，但與其他組MTT比較仍有顯著差異(P<0.05)。

2.4 法舒地爾體外誘導MSCs分化為神經細胞 未感染組MSCs誘導2 h，部分細胞出現神經細胞改變，胞體收縮成圓形，突起細長，有多個分支，部分在局部形成網絡。感染LV-rno-Let-7b-up組誘導后，細胞形態變化更為迅速和顯著，誘導2 h后多數細胞胞體收縮成圓形，細胞突起細長，交織成網，形成較典型的神經細胞結構(見圖3)。感染LV-rno-Let-7b-inhibition組誘導后，細胞形態變化更為緩慢，誘導2 h后少量細胞出現神經細胞改變，胞體收縮呈圓形，未見網絡形成見圖4。

圖3 感染Let-7b上調慢病毒后誘導分化2 h

圖4 感染Let-7b下調慢病毒后誘導分化2 h

2.5 免疫細胞化學染色法 感染LV-rno-Let-7b-up組誘導2 h后，NSE、MAP-2表達率分別為(90.1±1.7)%、(88.7±2.1)%，顯著高于未感染組和陰性對照組(P<0.05)。見圖5。感染LV-rno-Let-7b-inhibition組誘導2 h后，NSE、MAP-2表達率分別為(78±1.5)%、(76±1.8)%，顯著低于未感染組和陰性對照組(P<0.05)。見圖6。

圖5 感染Let-7b過表達慢病毒MSCs誘導分化后免疫組化MAP-2表達情況

圖6 感染Let-7b抑制慢病毒MSCs誘導分化后免疫組化MAP-2表達情況

2.6 RT-PCR結果 4組分別誘導分化2 h均表達MAP-2 mRNA，未轉染組和陰性對照組比無明顯差異，感染LV-rno-Let-7b-up組表達MAP-2 mRNA較未轉染組和陰性對照組明顯增多，差異有統計學意義(P<0.05)。感染LV-rno-Let-7b-inhibition組表達MAP-2 mRNA較未轉染組和陰性對照組明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

MSCs是一種來源于中胚層具有多向分化潛能的干細胞，可以分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌成纖維細胞[10]，且可打破胚層障礙分化成各種細胞類型，如可以在體內或體外，甚至是細胞移植到大腦或脊髓后表達神經外胚層的屬性[11]。

let-7家族主要在成人的腦組織及胚胎內高表達，在神經干細胞內表達也是上調的[7，12]。Let-7b作為let-7家族的成員，可以通過Toll樣受體7(Toll-like receptors 7，TLR7)信號通路激活小膠質細胞和巨噬細胞，TLR7參與了各種類型的神經系統炎癥損傷，包括神經系統退行性疾病，內源性的Let-7b可以通過 TLR7信號通路誘導神經細胞凋亡[13]；Let-7b以干細胞的調控因子TLX和細胞周期調控因子細胞周期蛋白Dl為靶點，抑制細胞增殖，促進干細胞分化[14]。TLX通過激活經典的Wnt信號在成體神經干細胞的自我修復和更新能力上起著至關重要的作用。Let-7b與TLX的3"UTR結合，降低TLX在神經干細胞中的表達水平[13]；此外，Let-7b還可通過Hmga2(high mobility group-AT-hook 2)進行調控，以促進胎兒和青年小鼠的中樞及外周神經系統內神經干細胞的自我更新[12]。

但Let-7b作為let-7家族的成員之一，在MSCs分化為神經細胞中的作用尚不清楚。本研究采用Let-7b過表達和抑制慢病毒載體感染MSCs，觀察其在MSCs誘導分化中的作用。本研究發現Let-7b過表達慢病毒載體可以高效感染大鼠MSCs，感染后基因表達EGFP可穩定表達，MTT結果發現感染Let-7b過表達慢病毒載體后MSCs存活率下降，但感染僅含有報告基因的慢病毒載體后MSCs存活率變化不大，免疫組化結果表明MSCs感染Let-7b過表達慢病毒載體后神經細胞分化效率顯著提高，神經細胞早、中期標志物NSE和成熟神經細胞特異性標志物MAP-2表達均明顯增高。這提示le-7b可能在MSCs橫向分化為神經細胞中起作用，提高Let-7b的表達可促進MSCs向神經細胞分化。但單獨感染Let-7b慢病毒載體并不能使MSCs向神經細胞分化，還必須在誘導劑法舒地爾的作用下才能分化。說明Let-7b在橫向分化為神經細胞中的作用不是唯一的，可能是對一些信號途徑控制，如TLR通路、Wnt信號通路、Hmga2通路等，從而提高誘導效率。

綜上所述，本研究采用慢病毒感染技術，建立Let-7b過表達和抑制模型，Let-7b過表達具有促進MSCs向神經細胞分化的作用，本研究為以后MSCs移植治療神經系統疾病提供廣泛前景。

[1] Yu JM, Wu X, Gimble JM, et al.Age-related changes in mesenchymal stem cells derived from rhesus macaque bone marrow[J].Aging cell, 2011, 10(1): 66-79.

[2] Kilpinen L, Tigistu-Sahle F, Oja S, et al.Aging bone marrow mesenchymal stromal cells have altered membrane glycerophospholipid composition and functionality [J].Journal of Lipid Research, 2013, 54(3): 622-635.

[3] Inui M, Martello G, Piccolo S.MicroRNA control of signal tr-ansduction[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2010, 11(4): 252-263.

[4] Guo L, Zhao RCH, Wu Y.The role of microRNAs in self-renewal and differentiation of mesenchymal stem cells[J].Experimental hematology, 2011, 39(6): 608-616.

[5] Laine SK, Hentunen T, Laitala-Leinonen T.Do microRNAs r-egulate bone marrow stem cell niche physiology[J].Gene, 2012, 497(1): 1-9.

[6] Ha M, Kim VN.Regulation of microRNA biogenesis[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2014, 15(8): 509-524.

[7] 景黎君, 賈永林, 魯晶晶, 等.MicroRNA-9-1 慢病毒載體的構建及其對小鼠骨髓間質干細胞誘導分化為神經細胞的影響[J].中國病理生理雜志, 2011, 27(2): 326-331.

[8] Viswanathan SR,Daley GQ.Lin28: A microRNA regulator with a macro role [J].Cell, 2010, 140(4): 445-449.

[9] Thornton JE, Gregory RI.How does Lin28 let-7 control development and disease[J].Trends in cell biology, 2012, 22(9): 474-482.

[10] Hermann A, List C, Habisch HJ, et al.Age-dependent neuroectodermal differentiation capacity of human mesenchymal stromal cells:limitations for autologous cell replacement strategies[J].Cytotherapy, 2010, 12(1): 17-30.

[11] 高慧麗，張廣宇，賈延劼, 等.阿爾茨海默病小鼠模型中骨髓間充質干細胞的神經分化[J].中國病理生理雜志, 2014, 30(3): 467-472.

[12] 段冉冉, 李燕飛, 賈延劼.Let-7 家族在阿爾茨海默病發病機制中的作用[J].國際生物醫學工程雜志, 2013, 36(5): 307-310.

[13] Lehmann SM, Krüger C, Park B, et al.An unconventional role for miRNA: let-7 activates Toll-like receptor 7 and causes neurodegeneration[J].Nature neuroscience, 2012,15(6):827-835.

[14] Zhao C, Sun GQ, Li S, et al.MicroRNA Let-7b regulates neural stem cell proliferation and differentiation by targeting nuclear receptor TLX signaling[J].Proceedings of the National Academy of Sciences, 2010, 107(5):1876-1881.

[15] Sun GQ, Ye P, Murai K, et al.miR-137 forms a regulatory loop with nuclear receptor TLX and LSD1 in neural stem cells[J].Nature communications,2011, 2:529.

(收稿2014-05-20)

Effect of lentiviral vector of Let-7b on differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells into neurons

ZhangJing,XuXiaoge,GongZhe,ZhaoShaoyun,HeXia,WangTianshu,JiaoShujie,TengJunfang,JiaYanjie

DepartmentofNeurology,TheFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

Objective To investigate the role of Let-7b in inducing bone marrow mesenchymal stem cell(MSCs) differentiation into neurons.Methods The lentiviral vector of Let-7b up (LV-rno-Let-7b-up) and inhibition (LV-rno-Let-7b-inhibition) was constructed and transfected into rat MSCs.The cells were divided into non-transfected group, transfected group 1(transfected with LV-rno-Let-7b-up), transfected group 2 (transfected with LV-rno-Let-7b-inhibition) and negative control group (transfected with empty virus).MSCs were treated with Fashudier as an inducer for triggering the cells to differentiate into neurons.The fluorescence expressed by transfected MSCs were observed under inverted fluorescence microscope.The mRNA expression of microtublin-associated protein 2 (MAP-2) was detected by RT-PCR.The expression of neuron-specific markers, neuron-specific enolase(NSE) and MAP-2 were measured by immunocytochemical method.The viability of MSCs was determined by MTT method.Results In LV-rno-Let-7b-up the best transfection efficiency(up to 92.1%±4.3%) and survival rate appeared when multiply of infection (MOI) was 10 and on 3rd day.In LV-rno-Let-7b-inhibition the best transfection efficiency (up to 90.3%±4.2%) and survival rate appeared when MOI was 20 and on 5th day.Fashudier induced MSCs to differentiate into neurons and the best efficiency of the induction was observed in transfected group 1.The expression levels of NSE and MAP-2 in transfected cells were higher than those in the cells of other group(P<0.05).Conclusion LV-rno-Let-7b-up has high transfection efficiency in rat MSCs.Higher differentiation rate from rat MSCs to neurons is induced by Fashudier after the cells are transfected with LV-rno-Let-7b-up.

Let-7b; Marrow mesenchymal stem cells; Neurons

R-332

A

1673-5110(2014)23-0001-04