原發性帕金森病患者皮膚活檢術檢測自噬功能研究

王雪晶 丁雪冰 馬明明 殷競爭 滕軍放(通訊作者)

1)鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052 2)河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室 鄭州 450052 3)河南省人民醫院神經內科 鄭州 450003

原發性帕金森病患者皮膚活檢術檢測自噬功能研究

王雪晶1，2)丁雪冰1，2)馬明明3)殷競爭1，2)滕軍放1，2)(通訊作者)

1)鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052 2)河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室 鄭州 450052 3)河南省人民醫院神經內科 鄭州 450003

目的 運用皮膚活檢術分別從自噬以及分子伴侶介導的自噬兩個方面評價原發性帕金森病(parkinson’s disease，PD)患者皮膚成纖維細胞的自噬水平的變化，初步探討自噬在PD發病機制中的作用。方法 收集PD患者23例及正常對照20例皮膚標本，并對PD病人進行UPDRSⅡ、UPDRSⅢ、Hoehn & Yahr分級法量表評分，運用皮膚活檢術收集PD組的皮膚標本。通過免疫組化法檢測微管相關蛋白輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain3，LC3)、Beclin-1的表達，用蛋白質印跡法(Western blot)檢測LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值變化以及Beclin-1。結果 與正常對照組相比，PD患者皮膚成纖維細胞Beclin-1、LC3表達上調，差異有統計學意義(P<0.05)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高，差異有統計學意義(P<0.05)。PD患者皮膚成纖維細胞巨自噬水平明顯上調，自噬水平異常調控可能參與PD的發生、發展過程。結論 通過皮膚活檢術檢測PD患者皮膚自噬水平用于帕金森病的早期診斷具有一定的臨床價值。

帕金森病；皮膚活檢；自噬

帕金森病(Parkinson’s Disease，PD)是一種中老年人常見的神經退行性疾病，臨床表現為隨意運動減少、行動遲緩、靜止性震顫以及姿勢反射障礙。帕金森病的運動障礙主要歸因于大腦中黑質紋狀體多巴胺能神經元的進行性變性缺失[1]。PD因其高致殘性、目前無法根治等特點，不僅嚴重影響患者的生活質量，同時給患者家庭及社會都造成了負面影響。目前，診斷主要依據為所表現的特征典型臨床癥狀。PD起病隱襲，對于早期臨床癥狀并不典型的病人，早期臨床癥狀特異性并不強，且缺乏有效的早期的分子診斷標志物，早期診斷仍比較困難[2]。自噬(autophagy)是真核細胞所特有的一種重要的高度保守的防御和保護機制，是細胞亞細胞膜結構發生動態的形態改變，并通過細胞溶酶體介導自身的大分子物質或受損的細胞器的吞噬降解過程[3]。目前，有不少學者對自噬與PD等神經退行性疾病的關系進行研究，但多以動物模型、細胞培養以及尸解腦組織為研究對象，而在體中自噬功能的評估研究甚少[4]。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取2012-06—2014-03在鄭州大學第一附屬醫院神經內科就診的原發性PD患者23例，均符合2006年中華醫學會神經病學分會運動障礙與帕金森病學組制訂的帕金森病診斷標準，未合并其他神經系統疾病。男13例，女10例；年齡42～64歲，平均(54.0±6.7)歲；病程2～5 a，平均(3.2±1.8)a。正常對照組20例來自鄭州大學第一附屬醫院外科手術病人，排除神經系統變性疾病以及其他慢性疾病，男12例，女8例；年齡41～65歲，平均(51.9±6.9)歲。2組一般資料比較見表1。本研究經鄭州大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準，所有受試者或家屬均簽署知情同意書。對所有的病人進行詳細的病史采集，填寫問卷調查，包括年齡、性別、文化程度、首發癥狀及其出現時間、病程進展情況、生活工作環境，有無毒物接觸史、有無家族史、有無吸煙、飲酒等嗜好；曾服用或正在服用的藥物及其服用劑量、時間，有無其他并發癥等。由研究者(神經內科專業醫師)對PD病人進行UPDRSⅡ、UPDRSⅢ、Hoehn & Yahr分級法量表。

1.2 皮膚活檢 在所有患者一側上臂背側肘關節上約10 cm處定位，用1%碘伏溶液常規消毒皮膚，2%利多卡因針對定位皮膚進行局部浸潤麻醉，數分鐘后選用皮膚大小合適孔徑的打孔機樣取皮器，左手固定皮膚，右手持取皮器在取材部位邊旋轉，邊向下用力，旋取5 mm×5 mm的皮膚標本，含皮下脂肪組織及真皮層，用帶齒鑷輕輕夾起標本并提起，用剪刀將皮膚標本從底部剪斷，取皮過程嚴格按照無菌操作要求進行，取皮后創口消毒、壓迫止血，用無菌紗布加壓包扎。

1.3 免疫組化法檢測皮膚組織Beclin-1、LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的分布 皮膚標本浸泡入4%多聚甲醛磷酸緩沖液(pH 7.4)內，在4℃環境下固定24 h，常規脫水、透明、浸潤，石蠟包埋，后應用組織切片機將標本連續切片，每片厚度6 μm，用于免疫組織化學染色。

1.4 免疫印跡檢測皮膚組織Beclin-1、LC3I/LC3II的表達 皮膚標本迅速置于已編號的凍存管中，然后立即放入盛有液氮的低溫保溫瓶中，后將凍存管移入-80℃低溫冰箱中保存。將蛋白樣本轉移至硝酸纖維濾膜上。用5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗3次，加入抗Beclin 1(1∶800)、抗LC3(1∶500)抗體，4℃過夜。加人過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(1∶5000)，置于水平脫色搖床上孵育1 h，TBST漂洗5次，ECL光化學法顯色。凝膠成像分析系統分析掃描。

2 結果

2.1 免疫組化檢測皮膚組織內源性Beclin 1 蛋白、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達 顯微鏡觀察，每個病人皮膚樣本取5張切片，選大致相同的位置技術陽性細胞數(10×40倍)，然后用數碼相機拍照。其中LC3、Beclin-1、LAMP2a免疫反應陽性細胞計數胞漿和胞核均呈棕褐色著色。如圖1、2所示。

圖1 免疫組化檢測皮膚組織內源性LC3蛋白的表達

圖2 免疫組化檢測皮膚組織內源性Belin-1蛋白的表達

2.2 免疫印跡檢測皮膚組織內源性Beclin 1 蛋白、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達 與正常對照組相比，PD的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達明顯上調(P<0.05)；與正常對照組相比，PD的Beclin-1表達明顯上調(P<0.05)。見圖3。

圖3 Western-blot檢測皮膚組織內源性LC3蛋白的表達

3 討論

PD多發于中老年人，為起病隱匿的慢性中樞神經系統退行性疾病。目前，PD的病因及發病機制尚不完全明確。多數學者認為PD是環境因素和遺傳因素共同作用的結果，環境中的神經毒素、年齡的老化、遺傳導致的突變蛋白等因素均可通過導致線粒體功能障礙、增加細胞氧化應激等機制誘導多巴胺能神經元的變性死亡[5]。大量研究表明，α-synuclein蛋白的錯誤折疊、降解障礙、異常聚集等可具有神經毒性，影響突觸功能以及信號的傳遞，最終亦可導致神經元變性，而所有的這些機制都與自噬機制緊密聯系。近期對常染色顯性和隱性遺傳家族性PD家系研究中發現，其相關基因產物也參與自噬的調控中。因此，近年來，越來越多的研究開始關注自噬在PD以及其他神經系統退行性疾病中所起到的作用，認識到有效的自噬調節可能成為將來PD等變性疾病治療的新突破。

自噬是真核細胞所特有的一種重要的高度保守的防御和保護機制，自噬介導真核細胞中長半衰期蛋白、功能異常或冗余的細胞器的代謝降解。目前廣泛認為，基礎水平的自噬活性在維持神經元細胞內環境穩態中起到必不可少的作用，自噬機制的失調可導致神經元變性[6]。自噬活性可多種不利條件下如營養缺乏、缺氧狀態、低能量供應等可被誘導，釋放降解產物，尤其是氨基酸等重新進入細胞質以供機體循環再利用。根據自噬過程中底物的種類、底物運送到溶酶體腔的方式不同，自噬可分為三種類型，微自噬(microautophagy)、巨自噬(macroautophagy)以及分子伴侶介導的自噬(chaperone-mediated autophagy)。巨自噬特征性標志是雙層膜自噬小體的形成，即細胞質中產生一C形雙層膜結構，其兩端延伸形成空泡，空泡中包裹部分細胞質、細胞器或者錯誤折疊、聚合的蛋白質，隨后自噬小體與溶酶體融合，自噬小體內層膜包裹的內容物進入溶酶體進行降解，從而有利于一些重要的細胞成分，尤其是必需氨基酸的再循環利用。

本研究對23例PD患者的皮膚進行活檢，并通過LC3、Beclin-1指標來評估自噬水平，由于考慮到年齡相關的因素，我們設立了年齡匹配的有效的健康對照組，其來源主要是在燒傷科以及外科手術的無神經系統疾病的患者。通過研究發現，與正常對照組相比，PD患者皮膚成纖維細胞Beclin-1、LC3II/I比值表達水平均上調，差異有統計學意義(P<0.05)，間接提示PD患者體內可能存在異常聚集、錯誤折疊的蛋白或受損、功能異常的細胞器，從而機體通過上調自噬水平來清除降解這些異常成分，起到保護作用。自噬在PD等神經退行性疾病的發生、發展過程中扮演著重要的角色，自噬上調的可能原因以及PD的發病過程中起到保護作用。

自噬調節有希望成為將來治療PD的潛在靶向目標。目前廣泛認為，氧化應激在PD的發病機制中起重要的作用。許多與PD相關的基礎以臨床研究均發現自噬和氧化應激是相互依賴的關系，從而提出通過自噬調節來抑制氧化應激很可能成為未來治療PD的新靶點。自噬在多種PD模型中均證實起到保護多巴胺神經元的作用，如通過雷帕霉素誘導自噬水平可有效抵抗魚藤酮導致的神經毒性發揮保護作用，防止多泛素化的聚合物形成[7]。為預防對免疫系統有害的不良反應，目前小劑量雷帕霉素聯合特異的抗氧化劑遏制黑質致密部進行性的氧化損傷已被接受。然而，另一些研究提出初級皮層神經元中海藻糖和雷帕霉素誘導的自噬可被巰醇抗氧化酶抑制。除此之外，一些物質可通過抑制基礎自噬活性水平從而導致PD模型中α-synuclein蛋白聚合物的增加[8]。另外，近些年，一些學者專家圍繞PD治療的熱點問題進行研究。首先，有神經病理學分析和動物實驗表明注射Beclin-1可促進邊緣系統中α-synuclein蛋白的清除，可能成為治療PD的創新性方法。其次，研究發現，敲除Rab1a基因可抑制自噬小體形成，促進α-synuclein蛋白的異常聚積[9]。因此，若Rab1的基因表達水平調控適當，從而可能啟動自噬途徑，加速異常聚積α-synuclein蛋白的清除。

綜上所述，PD的病因、發病機制十分復雜，多種機制相互作用參與其發病及發展過程中。本研究并不拘泥于某一種機制與自噬的關系，而從宏觀上觀察自噬活性在活體患者中的水平，并對造成這種現象的可能原因進行分析，對自噬在PD發病中的所扮演的角色有了初步了解。但這些復雜的機制如何調控自噬活性，其生物學意義是什么以及自噬發揮其細胞保護作用的具體機制如何，都需要有更多更深入樣本量更大的研究來進一步發掘驗證，為將來尋找PD有效可行的生物學標志物及開發治療這些疾病的新手段奠定理論基礎。

[1] Kondo Y, Kanzawa T, Sawaya R, et al. The role of autophagy in cancer development and response to theraphy[J]. Nat Rev Cancer, 2005, 5(9):726-734.

[2] Mizushima N, Levine B, Cuervo AM, et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion [J]．Nature, 2008, 451(7182): 1 069-1 075.

[3] Suzanne SM, James AH. Molecular characterization of light chain 3.A microtubule binding subunit of MAP1A and MAP1B [J]．J Biol Chem, 1994, 269(15):11 492-11 497.

[4] Kabeya Y, Mizushima N,Yamamoto A,et al. LC3, G-ABARAP and GATE16 localize to autophagosomal membrane depending on form-II formation [J]. J Cell Sci, 2004,117(13):2 805-2 812.

[5] Mizushima N. Methods for monitoring autophagy[J].Int J -Biochem Cell Biol, 2004, 36(12):2 491-2 502.

[6] Bandhyopadhyay U, Cuervo AM. Chaperone-mediated autophagy in aging and neurodegeneration: Lessons from a-synuclein [J].Exp Gerontol, 2007, 42(1): 120-128.

[7] Kon M, Cuervo AM. Chaperone-mediated autophagy in health and disease [J]. FEBS Lett, 2010, 584(1):1 399-1 404.

[8] Massey AC, Zhang C, Cuervo AM. Chaperone-mediated autophagy in aging and disease[J].Curr Top Dev Biol, 2006, 73:205-235.

[9] Boehncke WH，Dahlke A，Zollner TM，et al.Differential expression of heat shock protein 70(HSP70)and heat shock cognate protein 70(HSC70)in human epidermis[J]. Arch Dermatol Res, 1994, 287(1): 68-71.

(收稿2014-05-15)

Skin biopsy for assessment of autophagy dysregulation in the pathogenesis of Parkinson’s disease

WangXuejing＊,DingXuebing,MaMingming,YinJingzheng,TengJunfang

＊DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450003,China

Objective To assessment the function of chaperone-mediated autophagy (CMA), and macroautophagy in Parkinson’s disease patients using skin biopsy, and explore the role of autophagy in pathogenesis of Parkinson’s disease. Methods The study samples included 23 PD patients and 20 normal controls. Clinical data of all PD patients were collected, and graded by UPDRSⅡ, Hoehn & Yahr scales. Punch skin biopsies were taken from PD patients. Skin biopsy specimens were immunohistochemically stained with anti-LC3, anti-Beclin-1 and anti-LAMP2a antibodies. The expression of microtubule-associated protein1 light chain 3(LC-3), beclin-1, heat shock cognate protein70 (HSC-70), lysosome-associated membrane protein 2a (LAMP2a) were detected by Western blot.Results Beclin-1, LC3 immune positive cells optical density value in skin fibroblasts of PD was significantly more than that of the healthy controls(P<0.05). Western blot result showed LC3Ⅱ/LC3Ⅰ, Beclin-1 expression was significantly higher than that of control subjects(P<0.05).Conclusion Macroautophagy activity was higher in PD patients’ fibroblasts, and dysregulation of macroautophagy may participate in the process of PD.

Parkinson’s disease; Skin biopsy; Autophagy

國家自然科學基金項目(81100949，81301086)

R742.5

A

1673-5110(2014)23-0010-03