LRRK2活化Rho GTPases信號通路在小膠質細胞吞噬α-突觸核蛋白中的作用機制

丁雪冰 王雪晶 馬明明 滕軍放

1)鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052 2)鄭州大學帕金森病及相關運動障礙疾病研究所 鄭州 450052 3)河南省人民醫院神經內科 鄭州 450003

LRRK2活化Rho GTPases信號通路在小膠質細胞吞噬α-突觸核蛋白中的作用機制

丁雪冰1，2)王雪晶1，2)馬明明3)滕軍放1，2)

1)鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052 2)鄭州大學帕金森病及相關運動障礙疾病研究所 鄭州 450052 3)河南省人民醫院神經內科 鄭州 450003

目的 探討小膠質細胞吞噬α-突觸核蛋白的分子機制。方法 構建α-Syn寡聚體誘導BV-2細胞活化模型，免疫熒光檢測BV-2細胞內α-Syn陽性包涵體的數量。Western blot檢測BV-2細胞LRRK2蛋白的表達。Pull down檢測BV-2細胞Rac1、Cdc42、RhoA的活性。結果 與對照組相比，α-Syn寡聚體誘導BV-2細胞內α-Syn陽性包涵體數量增加，LRRK2蛋白表達增加及Rac1、Cdc42、RhoA活性增加。結論 小膠質細胞對α-突觸核蛋白的吞噬與LRRK2活化Rho GTPases信號通路相關。

LRRK2；Rho GTPases信號通路；小膠質細胞；α-突觸核蛋白

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是人類最常見的神經退行性疾病之一[1]。其病理特征為黑質致密部多巴胺神經元變性缺失及殘存神經元胞漿中異常聚集的α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-Syn)陽性路易小體的形成[2]。隨著研究的不斷深入，學者們發現在α-Syn陽性包涵體胞間播散過程中，小膠質細胞作為重要的傳遞媒介，在大量吞噬異常聚集的α-Syn后被持續激活,導致神經元損傷[3-4]。由此推測α-Syn陽性包涵體在小膠質細胞間播散在PD進展中起重要作用。

α-Syn寡聚體通過小膠質細胞胞吞作用在相鄰細胞之間傳遞[5]，進入受體細胞的α-Syn寡聚體，可以像“朊蛋白”一樣作為“種子”誘導正常構象的α-Syn蛋白錯誤折疊最終形成α-Syn陽性包涵體。通過這種模式α-Syn陽性包涵體在細胞間播散[6]，導致神經元的損傷從黑質向其他腦區擴散。而抑制α-Syn寡聚體的胞間傳遞能夠阻斷LB的細胞間播散，從而減少神經元的損傷。LRRK2基因(1eucine rich repeat kinase 2 gene，PARK8；OMIM 607060)位于細胞質內，定位于細胞膜、細胞器膜等膜結構，作為分子開關參與細胞信號傳導、骨架重塑及膜轉運等多種生理過程[7]。我們的前期研究發現LRRK2作為Rho GTPase的調控因子，介導上皮細胞吞噬能力增強。因此LRRK2很可能參與調控小膠質細胞對于α-Syn寡聚體的吞噬。本研究以小膠質細胞吞噬α-Syn寡聚體為切入點，檢測LRRK2活化Rho GTPases信號通路在小膠質細胞吞噬α-突觸核蛋白中的作用機制，探索PD神經元損傷的病理機制。

1 材料與方法

1.1 材料 BV-2細胞由本實驗室保存。DMEM培養基、胎牛血清購于美國GIBCO公司。LRRK2抗體購于美國Cell Signaling公司，α-Syn抗體購于美國 Santa Cruz Biotechnology公司，過氧化物酶標記山羊抗兔IgG購于美國Promega公司，Alexa Fluor 633 標記 Phalloidin購于美國Molecular Probes公司。Rac/Cdc42 Assay Reagent (PAK1 PBD，agarose)或 Rho Assay Reagent (Rhotekin RBD, agarose) 購于美國Millipore公司。人源重組α-Syn凍干粉購于Sigma公司。

1.2 α-Syn寡聚體誘導BV-2細胞活化模型的構建 BV-2細胞以1×106接種到12孔板中培養24 h后，換無血清培養基，實驗組中加入終濃度0.5 μM的α-Syn寡聚體，對照組加入相應體積PBS，并于37℃ 5% CO2中孵育24 h。

1.3 免疫熒光檢測BV-2細胞內α-Syn陽性包涵體 收獲細胞，PBS洗2次。加入-20℃預冷的丙酮于-20℃孵育10 min，再加入0.1% Triton，常溫孵育5 min，PBS洗3次。5% BSA 37℃孵育30 min。加入α-Syn抗體(1∶1000)4℃孵育過夜，PBS洗3次。加入Alexa Fluor 488 標記羊抗兔二抗(1∶1000) 4℃孵育3 h，PBS洗3次。加入DAPI(1∶400)，常溫孵育3 min。于干凈的載玻片滴加封片劑，常溫下避光晾干過夜，于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.4 Western blot檢測BV-2細胞蛋白表達 構建α-Syn寡聚體誘導BV-2細胞活化模型，提取細胞總蛋白，做SDS-PAGE電泳，將蛋白轉移至硝酸纖維濾膜上。用5%脫脂奶粉封閉1 h，PBS洗3次，加入LRRK2及GTP-Rac1、GTP-Cdc42、GTP-RhoA抗體(1∶1000)，4℃過夜。加入過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(1∶5000)孵育2 h，PBS洗3次，ECL光化學法顯色。凝膠成像分析系統分析掃描。

1.5 Pull down檢測BV-2細胞Rac1、Cdc42、RhoA活性 0.5 mL預冷的細胞裂解液MLB裂解細胞10 min，離心收集上清。加入GST，冰上孵育10 min，離心收集上清。冰上取1 mL細胞提取液，加入20 μL Rac/Cdc42 Assay Reagent (PAK1 PBD, agarose)或 Rho Assay Reagent (Rhotekin RBD, agarose)冰上孵育2 h。離心去上清，500 μL Wash Buffer 洗滌沉淀，所得蛋白做Western blot檢測GTP-Rac1、GTP-Cdc42、GTP-RhoA蛋白表達。

1.6 統計學分析 應用AlphaEaseFC(FluorChem8900)軟件分析圖像結果。

2 結果

2.1 免疫熒光檢測BV-2細胞內α-Syn陽性包涵體 構建α-Syn誘導BV-2細胞活化模型。免疫熒光結果顯示，與對照組相比，α-Syn誘導BV-2細胞中α-Syn陽性包涵體數量增高。如圖1所示。

圖1 免疫熒光檢測BV-2細胞中α-Syn陽性包涵體(免疫熒光×400)

2.2 Western blot檢測BV-2細胞LRRK2蛋白表達 Western blot結果顯示，與對照組相比，α-Syn誘導BV-2細胞LRRK2蛋白表達增高。如圖2所示。

圖2 Western blot檢測BV-2細胞LRRK2蛋白表達

2.3 Pull down檢測BV-2細胞Rac1、Cdc42、RhoA活性 構建α-Syn誘導BV-2細胞活化模型。Pull down結果顯示，與對照組相比，α-Syn誘導BV-2細胞中GTP-Rac1、GTP-Cdc42、GTP-RhoA表達增高。表明Rac1、Cdc42、RhoA活性增高。如圖3所示。

圖3 Pull down檢測BV-2細胞Rac1、Cdc42、RhoA活性

3 討論

研究表明α-Syn陽性包涵體胞間播散介導的小膠質細胞活化，在PD進展中起到重要作用。小膠質細胞是中樞神經系統的重要免疫炎癥反應細胞，研究表明，小膠質細胞與DA神經元通過細胞間、細胞分子間的網絡式作用相互聯系參與了帕金森病的發生發展過程[8,9]。在α-Syn寡聚體的細胞間傳遞所介導的神經元損傷中，小膠質細胞的活化扮演了重要角色。作為免疫效應細胞，小膠質細胞具有強大的吞噬功能。研究表明小膠質細胞能夠吞噬α-Syn寡聚體及單體，作為α-Syn寡聚體傳遞的重要載體，加速α-Syn陽性包涵體的細胞間播散，促進PD的發展。研究表明，米諾環素、白細胞介素-10等抑制小膠質細胞活化的藥物能夠減輕PD模型DA神經元損傷。因此，調控小膠質細胞吞噬功能的因子很可能通過促進α-Syn寡聚體的內吞而激活小膠質細胞，介導DA神經元的損傷，從而推動PD的進展。

LRRK2基因是新近在散發性、家族聚集性常染色體顯性遺傳的帕金森病患者中發現的致病基因。在細胞水平上LRRK2位于細胞質內，參與細胞膜轉運等生理過程。LRRK2具有6個主要功能區域，其中ROC區域具有GTPases水解酶活性[10]，通過直接結合調控Rho GTPases的活性。研究表明，ROC區域與PD有關的突變(R1441C, R1441G)減弱了GTPase水解活性，增強了與GTP的結合，導致Rho GTPases的活化,引起細胞骨架重塑及神經元結構和功能的改變,這也是LRRK2致病的主要機制[11]。我們的前期研究發現，LRRK2很可能通過調控Rho GTPases信號通路的活化而在上皮細胞吞噬功能中起重要作用。尸檢發現路易小體中LRRK2與α-Syn存在共定位。在α-Syn A53T轉基因小鼠體內過表達LRRK2會加重表型及病變進展。以上研究表明，LRRK2與α-Syn的相互作用參與了PD的發病過程。

本研究發現小膠質細胞對α-Syn的吞噬與LRRK2的表達上調及Rho GTPases信號通路活化相關。由此我們認為，LRRK2活化Rho GTPases信號通路促進了小膠質細胞吞噬α-Syn寡聚體；調控LRRK2可能成為PD治療一個新的方向。

[1] MassanoJ.Parkinson's disease: a clinical update[J].Acta Medica Portuguesa,2011, 24(Suppl4):827-834.

[2] Mollenhauer B, Forstl H, Deuschl G,et al. Lewy body and parkinsonian dementia: common, but often misdiagnosed conditions[J]. Deutsches Arzteblatt International, 2010,107(39): 684-691.

[3] Beraud D, Maguire-Zeiss KA. Misfolded alpha-synuclein and Toll-like receptors: therapeutic targets for Parkinson's disease[J]. Parkinsonism & Related Disorders,2012,18 (Suppl1):S17-S20.

[4] Hosoi T, Ozawa K. Molecular approaches to the treatment, prophylaxis, and diagnosis of Alzheimer's disease: endoplasmic reticulum stress and immunological stress in pathogenesis of Alzheimer's disease[J]. Journal of Pharmacological Sciences,2012,118(3): 319-324.

[5] Freundt EC, Maynard N, Clancy EK, et al. Neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein fibrils through axonal transport[J]. Annals of Neurology, 2012, 72(4): 517-524.

[6] Olanow CW, Brundin P. Parkinson's disease and alpha synuclein: is Parkinson's Disease a prion-like disorder[J].Movement Disorders, 2013, 28(1): 31-40.

[7] Biosa A, Trancikova A, Civiero L, et al. GTPase activity regulates kinase activity and cellular phenotypes of Parkinson's disease-associated LRRK2[J]. Human Molecular Genetics，2013, 22(6): 1 140-1 156.

[8] Depboylu C, Stricker S, Ghobril JP,et al. Brain-resident microglia predominate over infiltrating myeloid cells in activation, phagocytosis and interaction with T-lymphocytes in the MPTP mouse model of Parkinson disease[J]. Experimental Neurology，2012，238(2): 183-191.

[9] Tseng YT, Hsu YY, Shih YT, et al. Paeonol attenuates microglia-mediated inflammation and oxidative stress-induced neurotoxicity in rat primary microglia and cortical neurons[J]. Shock，2012, 37(3): 312-318.

[10] Jebelli JD, Dihanich S, Civiero L,et al. GTP binding and intramolecular regulation by the ROC domain of Death Associated Protein Kinase 1[J]. Scientific Reports，2012, 2: 695.

[11] Anand VS, Braithwaite SP. LRRK2 in Parkinson's disease: biochemical functions[J]. The FEBS Journal，2009, 276(22): 6 428-6 435.

(收稿2014-05-10)

The functions and mechanisms of Rho GTPases signaling pathway activation induced by LRRK2 in microglial phagocytosis of α-synuclein

DingXuebing＊,WangXuejing,MaMingming,TengJunfang

＊DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhu450052,China

Objective To investigate the mechanism of microglial phagocytosis of α-synuclein.Methods BV-2 cells activation model induced by α-synuclein oligomers was established. Immunofluorescence stain was performed to detect α-synuclein-positive inclusions in BV-2 cells. Western blot was performed to detect LRRK2 expression in BV-2 cells. Pull down was performed to detect Rho GTPases signaling pathway activation in BV-2 cells.Results Compared with the control group,α-synuclein-positive inclusions, LRRK2 expression and Rho GTPases signaling pathway activity in BV-2 cells significantly increased in theα-synuclein group.Conclusion The Rho GTPases signaling pathway activation induced by LRRK2 associate closely with microglial phagocytosis of α-synuclein.

LRRK2; Rho GTPases signaling pathway; Microglia; α-synuclein

國家自然科學基金項目(81301086)

R329.2

A

1673-5110(2014)23-0017-03