α-硫辛酸對(duì)潰瘍性結(jié)腸大鼠模型脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的保護(hù)作用

李軍華，周 薇

(荊門(mén)市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 荊門(mén) 448000)

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)是一種病因尚不十分清楚的非特異性腸道炎癥性疾病，在我國(guó)的發(fā)病呈上升趨勢(shì)，其復(fù)發(fā)率高，目前尚缺乏非常有效的治療手段[1]。炎癥反應(yīng)及過(guò)多的氧自由基(oxygen free radical，OFR)產(chǎn)生及引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷可通過(guò)多種途徑參與UC的發(fā)病[2，3]。α-硫辛酸(α-LA)屬于維生素B類(lèi)化合物，是一種強(qiáng)的抗氧化劑，具有直接清除活性氧及再生抗氧化劑的作用[4，5]，在糖尿病、冠心病、缺血再灌注損傷保護(hù)等方面有確切療效，但其對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎影響的研究較少。本實(shí)驗(yàn)觀察α-硫辛酸對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸粘膜脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的影響，探討α-硫辛酸是否對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎具有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級(jí)健康成年SD大鼠30只，雌雄不拘，體質(zhì)量180±30g，由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，喂養(yǎng)環(huán)境溫度22℃～24℃，自由飲食水。實(shí)驗(yàn)方案符合動(dòng)物研究指南并經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。三硝基苯磺酸為Sigma公司產(chǎn)品， 丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和髓過(guò)氧化物酶(MPO)，測(cè)定試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，α-硫辛酸(α-LA)為上海現(xiàn)代哈森藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立與分組 大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型參照文獻(xiàn)[6]建立。術(shù)前禁食24h，自由飲水。30只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、結(jié)腸炎模型組及硫辛酸組共3組，每組10只。模型組及硫辛酸組大鼠實(shí)驗(yàn)前采用乙醚吸入麻醉，將一直徑約2.0 mm的軟橡膠管石蠟潤(rùn)滑后由肛門(mén)輕緩插入結(jié)腸約8cm，將5%(w/v)的2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)/無(wú)水乙醇混合液(體積比1∶1)按100mg/kg(0.4ml/100g)緩慢灌入大鼠腸內(nèi)；灌腸完成后避免灌注液流出肛門(mén)，動(dòng)物平躺至自然清醒。對(duì)照組用生理鹽水溶液代替TNBS灌腸，硫辛酸組在造模后給予α-硫辛酸鹽液腹腔注射，100mg/(kg·d)，連續(xù)兩周。每天觀察大鼠精神、食欲、腹瀉及體重變化等情況并記錄，計(jì)算疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)[7]。

1.2.2 標(biāo)本收集與處理 兩周后處死大鼠，取肛門(mén)至盲腸部結(jié)腸，將腸管沿腸系膜縱軸剪開(kāi)，以冰生理鹽水洗凈。進(jìn)行腸道損傷大體形態(tài)評(píng)分，每例結(jié)腸組織分為兩部分，一部分卷起來(lái)以4.0%多聚甲醛固定，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，HE染色后進(jìn)行病理組織學(xué)損傷評(píng)分，另一部分組織準(zhǔn)確稱(chēng)重后剪碎，低溫下生理鹽水勻漿，一部分勻漿用于檢測(cè)MPO，余下以3000r/min離心10min后取上清液-80℃保存用于其他生化指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.3 結(jié)腸組織損傷大體形態(tài)和組織學(xué)形態(tài)評(píng)分方法 參照文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)[6，8]略作修改，大體評(píng)分指標(biāo)包括充血水腫、潰瘍及粘連，按有無(wú)及輕重分別計(jì)0、1、2分，潰瘍個(gè)數(shù)每增加1個(gè)、潰瘍面積每增加1cm2(>2cm2時(shí))計(jì)分加1。組織學(xué)評(píng)分指標(biāo)為炎癥、潰瘍及潰瘍累及深度，按有無(wú)及輕重分別計(jì)0、1、2分，病變深度達(dá)粘膜下層、肌層、漿膜層分別計(jì)1、2、3分，各項(xiàng)相加得總分。

1.2.4 結(jié)腸組織MDA、SOD、GSH及MPO檢測(cè) 采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測(cè)定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性，比色定量法檢測(cè)GSH含量，分光光度法測(cè)定MPO活力；具體操作過(guò)程按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況改變 大鼠造模后第1d出現(xiàn)腹瀉、稀便，食欲減退，活動(dòng)減少、精神倦怠，蜷縮，第4d開(kāi)始模型組大鼠均出現(xiàn)毛色失去光澤，體質(zhì)量減輕，并有大鼠開(kāi)始出現(xiàn)血便，上述癥狀隨時(shí)間逐漸明顯。對(duì)照組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)，無(wú)異常表現(xiàn)。α-硫辛酸組與模型組相比，上述癥狀均有不同程度減輕，α-硫辛酸組大鼠未觀察到有肉眼血便情況，DAI評(píng)分明顯低于模型組(P<0.01)，見(jiàn)表1。

2.2 大鼠腸道大體形態(tài)及組織學(xué)損傷改變 模型組大鼠結(jié)腸炎癥改變部位以近肛門(mén)段結(jié)腸為主，腸粘膜充血水腫明顯，可見(jiàn)潰瘍形成，潰瘍周邊粘膜充血水腫。結(jié)腸腸管變粗，部分節(jié)段見(jiàn)局部膨脹，腸壁變薄。腸壁外周可見(jiàn)粘連形成。α-硫辛酸組大鼠腸粘膜充血水腫明顯減輕，偶見(jiàn)潰瘍，未見(jiàn)腸管擴(kuò)張及粘連形成。對(duì)照組大鼠腸粘膜血管網(wǎng)清晰，未見(jiàn)明顯充血水腫。組織學(xué)損傷以粘膜層及粘膜下層常見(jiàn)，可見(jiàn)粘膜缺損或潰瘍形成，嚴(yán)重時(shí)病變累及到肌層。以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主，也可見(jiàn)數(shù)量不等的巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞。α-硫辛酸干預(yù)組大鼠結(jié)腸組織損傷明顯減輕，糜爛及潰瘍有不同程度修復(fù)，腸粘膜可見(jiàn)再生的上皮細(xì)胞、腺體及肉芽組織，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，以散在的巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞為主。大體形態(tài)及組織學(xué)損傷評(píng)分指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠結(jié)腸大體形態(tài)、組織學(xué)損傷評(píng)分和疾病活動(dòng)指數(shù)比較

2.3 各組大鼠腸組織MDA、SOD、GSH及MPO含量變化 與對(duì)照組相比，結(jié)腸炎模型組大鼠腸組織MDA、MPO含量明顯上升，SOD活性、GSH含量明顯降低(P<0.01)，α-硫辛酸組大鼠腸組織MDA、MPO含量較模型組明顯下降，SOD活性及GSH含量較模型組顯著上升(P<0.01)，與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠結(jié)腸組織SOD、MPO活性及MDA、GSH含量比較

3 討 論

三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)形成的UC模型與人類(lèi)UC病理及發(fā)病機(jī)制有一定相似之處。TNBS是一種半抗原，可與結(jié)腸內(nèi)的自身蛋白結(jié)合形成完全抗原，激活粘膜免疫系統(tǒng)，引起一系列免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，是目前篩選新藥常用的模型。MPO是中性粒細(xì)胞中含量較高的一種酶，其在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中也少量存在，其含量高低可間接反映組織炎癥浸潤(rùn)程度，被作為評(píng)價(jià)腸道炎癥嚴(yán)重程度的指標(biāo)[9]。本實(shí)驗(yàn)采用TNBS灌腸造模后，模型組大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)，大體形態(tài)及組織學(xué)損傷評(píng)分及MPO含量較正常對(duì)照組明顯上升，取得較好造模效果。

氧自由基(OFR)在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病中的作用已得到廣泛認(rèn)同[2，3]。OFR是一類(lèi)具有高度化學(xué)反應(yīng)活性的含氧基團(tuán)，可作用細(xì)胞中的脂類(lèi)物質(zhì)產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，造成組織及細(xì)胞損傷。UC中，OFR主要吞噬細(xì)胞發(fā)揮吞噬作用是大量產(chǎn)生，機(jī)體產(chǎn)生的OFR可導(dǎo)致生物膜中多鏈不飽和脂肪酸過(guò)氧化反應(yīng)直接引起細(xì)胞損傷，其還可以增加粘膜通透性，使吞噬細(xì)胞活動(dòng)加強(qiáng)，產(chǎn)生更多的OFR，同時(shí)脂質(zhì)過(guò)氧化物的分解產(chǎn)物MDA也能引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞，蛋白質(zhì)變性交聯(lián)，DNA 結(jié)構(gòu)破壞，炎癥因子大量釋放，加重組織的損害，形成炎癥與組織損傷的惡性循環(huán)。SOD是存在于生物體內(nèi)的重要的抗氧化酶系，能有效地清除氧自由基。而谷膚甘肽(GSH)是一種低分子清除劑，在谷胱甘肽過(guò)氧化酶(GSH-PX)作用下將過(guò)氧化物還原為無(wú)害的羥基化合物，同時(shí)它也能穩(wěn)定含巰基的酶和防止血紅蛋白及其它輔助因子受氧化損傷。生理情況下，氧化與抗氧化系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡。直接測(cè)定OFR非常困難，由于MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的終末產(chǎn)物，因此其含量可反映機(jī)體脂質(zhì)化損傷的程度，SOD活力及GSH含量間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，UC大鼠腸組織中MDA含量較正常大鼠明顯上升，SOD活力及GSH含量明顯下降，支持了氧自由基導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化損傷參與UC發(fā)病的觀點(diǎn)。

阻斷OFR產(chǎn)生或提高機(jī)體清除OFR能力可阻斷炎癥發(fā)展的惡性循環(huán)，研究具有抗氧化活性的藥物對(duì)UC的作用一直是臨床關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。α-硫辛酸是在已知天然抗氧化劑中效果最強(qiáng)的，兼具脂溶性和水溶性，具有顯著的親電性和與自由基反應(yīng)能力，可以清除活性氧自由基，同時(shí)它還能再生內(nèi)源性抗氧化劑如GSH等，提高抗氧化酶的活性，被稱(chēng)為“抗氧化劑的抗氧化劑”。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，α-硫辛酸干預(yù)處理潰瘍性結(jié)腸炎大鼠后，大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)與腸道損傷程度較模型組明顯減輕，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，α-硫辛酸組大鼠腸組織中MDA、MPO含量較模型組明顯降低，SOD活性和GSH含量較模型組大鼠明顯提升。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示α-硫辛酸對(duì)UC大鼠具有良好的保護(hù)作用，其機(jī)制與清除氧自由基，提升SOD活性和GSH含量，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化損傷有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)為α-硫辛酸應(yīng)用與UC臨床治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)炎癥性腸病學(xué)組.炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(jiàn)(2012 年廣州)[J].胃腸病學(xué)，2012，17(12):763

[2]Jena G，Trivedi PP，Sandala B.Oxidative stress in ulcerative colitis：an old concept but a new concern[J].Free Radic Res，2012，46(11):1339

[3]Nieto N，Torres MI，F(xiàn)ernandez MI，et al.Experimental ulcerative colitis impairs antioxidant defense system in rat intestine[J].Dig Dis Sci，2000，45:1820

[4]Rochette L，Ghibu S，Richard C，et al.Direct and indirect antioxidant properties of α-lipoic acid and therapeutic potential[J].Mol Nutr Food Res，2013，57(1):114

[5]王新容.α-硫辛酸的臨床應(yīng)用概況[J].海峽醫(yī)學(xué)，2013，25(8):18

[6]Keshavarz A，Minaiyan M，Ghannadi A，et al.Effects of Carum carvi L.(Caraway)extract and essential oil on TNBS-induced colitis in rats[J].Res Pharm Sci，2013，8(1):1

[7]Chen da F，Lu LG，Tao KZ，et al.Recovery from TNBS-induced colitis leads to the resistance to recurrent colitis and an increased ratio of FOXP3 to CD3 mRNA[J].J Dig Dis，2013，14(11):587

[8]Yu Q，Zhu S，Zhou R，et al.Effects of sinomenine on the expression of microRNA-155 in 2，4，6-trinitrobenzenesulfonic acid-induced colitis in mice[J].PLoS One，2013，8(9)：e737571

[9]Nagib MM，Tadros MG，ElSayed MI，et al.Anti-inflammatory and anti-oxidant activities of olmesartan medoxomil ameliorate experimental colitis in rats[J].Toxicol Appl Pharmacol，2013，271(1):106