桂枝茯苓膠囊對慢性盆腔炎大鼠VEGF與炎癥因子表達影響研究

尹耀明

(江蘇省溧陽市婦幼保健醫院 藥劑科, 江蘇 溧陽, 213300)

慢性盆腔炎(CPID)作為臨床婦科的常見病，其主要特征為以腹痛、帶下、盆腔組織發生增厚、黏連以及形成盆腔包塊等[1]。慢性盆腔炎反復發作，能夠導致宮外孕、不孕以及神經官能癥等，嚴重影響婦女健康，如何防治慢性盆腔炎始終是臨床研究的重點課題之一[2-3]。本實驗通過建立盆腔炎動物模型，以免疫調節角度出發，分析桂枝茯苓膠囊對慢性盆腔炎模型大鼠血管內皮生長因子(VEGF)及炎癥細胞因子表達的影響，旨在為臨床治療慢性盆腔炎提供參考。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

選取SPF級成年健康的Wistar雌性大鼠共120只作為本實驗的實驗動物，購自于遼寧長生生物技術有限公司，實驗動物合格證號為 SCXK(遼) 2010-000, 大鼠體質量為(220±25) g, 鼠齡6～8周，飼養條件：室溫20 ℃～22 ℃, 濕度40%～70%, 標準飼料，采用自主攝食、自由飲水的方式喂養。常規飼養1周后進行實驗操作。

1.2 實驗試劑及儀器

IL-1β、IL-8及TNF-α的ELISA 檢測試劑盒(產自美國ADL公司); VEGF抗體(購自于北京博奧森生物技術有限公司)；大腸桿菌及金黃色葡萄球菌(遼寧省衛生防疫站提供)；戊巴比妥鈉(購于上海化學試劑公司); ELX800 酶標儀(產自美國 BIO-TEKS公司); CX41光學顯微鏡(產自日本OLYMPUS公司); HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(產自武漢同濟醫科大學千屏影像工程公司); BP310S 電子天平(產自德國Sartorius公司)；高速低溫離心機3K-30(產自于美國Sigma公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組：依據完全隨機原則，將大鼠隨機分為正常對照組、假手術組、模型組以及桂枝茯苓膠囊組共4組，每組30只，正常對照組組正常飼養，不采取任何干預措施，假手術組(開腹后每側宮腔內各注入0.1 mL無菌蒸餾水后關腹)，模型組及桂枝茯苓膠囊組進行慢性盆腔炎造模。

1.3.2 建立慢性盆腔炎動物模型：參照文獻[4]應用混合細菌聯合機械損傷法，具體方法為：采取1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉劑量標準為30 mg/kg, 待麻醉效果滿意后，取仰臥位，將大鼠的頭和四肢固定在操作臺上，腹中部常規備皮、消毒， 在下腹正中作一長約1cm的切口，沿腹正中線剪開皮膚，進入腹腔后，于膀胱后方找出并充分暴露子宮，用注射器對子宮內膜組織造成機械損傷后，每側宮腔內注射0.1 mL混合細菌懸液，將子宮回歸原位, 1#絲線對腹壁和皮膚進行連續縫合，關腹，術畢。術后動物采用常規喂養方式，不給予抗生素治療。

1.3.3 給藥方法：桂枝茯苓膠囊組：應用桂枝茯苓膠囊治療，生產單位：江蘇康緣藥業股份有限公司，國藥準字: Z10950005, 計量標準為1.0 g/kg, 利用蒸餾水制成1 mL的懸濁液， 每日上午9時灌胃給藥，其他組同時給予1 mL生理鹽水灌胃治療。末次給藥后，采用心臟取血方法獲取5 mL血液，經離心處理后，取上層血清放置在-30 ℃冰箱中保存待測。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 子宮形態學改變：新鮮子宮組織在固定、脫水、透明及石蠟包埋處理后，制作切片，常規進行蘇木精-伊紅(HE)染色。應用光學顯微鏡進行形態學觀察。

1.4.2 檢測子宮組織中VEGF表達情況：應用光學顯微鏡觀察VEGF陽性細胞集中區域，利用HPIAS-1000 高清晰度彩色病理圖文分析系統進行計算機完全定量分析。VEGF表達陽性標準：胞漿、胞核、胞膜呈棕黃色顆粒。在相數點長為0.832μm、統計場總面積為4.3e+0.05的條件下,每張切片陽性細胞比=陽性目標面積/統計場總面積÷[(陰性目標面積+陽性目標面積)/統計場總面積]。

1.4.3 檢測血清中IL-1β、IL-8及TNF-α表達水平：依據ELISAkit 操作說明書進行測定，在光密度值為450 nm處，參照標準管光密度值應用 Cruve Expert 1.3軟件作標準曲線，依據標準曲線計算IL-1β、IL-8、IL-10及 TNF-α濃度。

2 結 果

2.1 子宮形態學改變

正常對照組：子宮的大小及形態正常，與周圍組織未發生粘連，子宮內膜未見充血水腫，肌纖維紋理顯示清晰，極少數腺體輕度增生。假手術組：子宮大小及形態接近正常，未見與周圍組織粘連，子宮內膜無充血水腫，肌纖維紋理較為清晰，腺體偶有輕度增生；模型組：子宮變大，質硬，部分大鼠可見宮腔積液、盆腔充血，與周圍組織可見明顯的組織粘連，部分大鼠可見肉芽腫，子宮組織可見上皮增生、鱗化，肌纖維紋理紊亂，部分腺體囊性增生，固有層腺體發生壞死及炎性細胞浸潤，可見嗜酸性粒細胞；桂枝茯苓膠囊組：子宮大小及形態與正常接近，與周圍組織無明顯粘連，子宮內膜輕度充血，呈增生樣改變，固有膜可見嗜酸性粒細胞少量散在存在。

2.2 各組子宮組織中VEGF表達水平比較

假手術組大鼠的VEGF陽性表達水平與正常對照組無顯著差異(P>0.05); 模型組及桂枝茯苓膠囊組子宮組織中的VEGF陽性表達顯著高于正常組及假手術(P<0.01)。見表1。

2.3 各組血清中IL-1β、IL-8及TNF-α表達水平比較

模型組IL-1β、IL-8及TNF-α陽性表達水平顯著高于正常對照組及假手術組比較(P<0.01); 桂枝茯苓膠囊組IL-1β、IL-8及TNF-α陽性表達雖略有升高，但是顯著低于模型組(P<0.01), 并且與正常對照組及假手術組相比,P>0.05, 不具有顯著性差異。見表2。

表1 各組大鼠子宮組織中VEGF陽性表達比較

表2 各組大鼠血清IL-1β、IL-8及TNF-α表達水平比較

3 討 論

慢性盆腔炎可累及多部位，其具有發病率高，病情頑固，復發率高的特點[5]。慢性盆腔炎作為病原體感染導致的盆腔組織炎癥反應，雖然并沒有直接的細菌感染證據，但是其能夠侵襲盆腔器官，導致局部血流障礙、組織代謝力下降，相關研究認為其病情進展與免疫病理損傷，炎性細胞因子異常表達密切相關[6-7]。桂枝茯苓膠囊為桂枝茯苓丸經醇提加水提精制而成，具有活血化瘀、消癥止痛的功效，被譽為“活血化瘀第一方”。桂枝茯苓膠囊其主要藥物成分為桂枝、茯苓、芍藥、牡丹皮及桃仁，桂枝、茯苓合為君藥，能夠化氣，利濕，益心脾，健脾土，促使痰生無源；丹皮、赤芍合桃仁能夠化瘀血，清瘀熱，諸藥合用，陰陽調和，氣血流暢，活血化瘀，消癥塊，緩疼痛。現代藥理研究發現桂枝茯苓膠囊不僅具有抗炎、鎮痛、鎮靜的作用，而且能夠調解免疫功能，改善微循環，目前已經成為臨床治療CPID的常用藥物[8-9]。施慧等[10]通過實驗發現桂枝茯苓膠囊能夠降低CPID大鼠MDA、TXB2、IL-1β及TNF-α表達，上調SOD活性，提高6-keto-PGF1表達，提示桂枝茯苓膠囊能夠減輕氧自由基損傷，抑制促炎癥細胞因子表達，維持PGI2/TXA2平衡，從而有效治療慢性盆腔炎。本實驗中，應用桂枝茯苓膠囊干預的慢性盆腔炎大鼠，不僅病理改變顯著減輕，而且IL-1β、IL-8及TNF-α等促炎性細胞因子陽性表達顯著低于模型組，其VEGF陽性表達顯著提高，說明桂枝茯苓膠囊能夠通過促進VEGF表達、降低促炎性因子表達發揮治療慢性盆腔炎的功效。

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[5] 王小英, 林玉蘭. 中西醫結合治療慢性盆腔炎60例觀察[J].上海預防醫學雜志, 2011, 23(12): 649.

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[7] 谷風. 利濕化瘀法對慢性盆腔炎大鼠血清SOD、MDA影響的實驗研究[J]. 陜西中醫, 2010, 31(4): 496.

[8] 孫蘭, 林楠, 呂耀中, 等. 桂枝茯苓膠囊對大鼠慢性盆腔炎的影響[J].中藥藥理與臨床雜志, 2013, 29(4): 21.

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[10] 施慧, 王靚, 龍子江, 等. 桂枝茯苓膠囊保留灌腸治療慢性盆腔炎的實驗研究[J]. 山西中醫學院學報, 2013, 14(1): 11.