家蠅幼蟲抗菌物質的誘導及抗菌活性研究

潘靈鋒,趙雙雙

(湖北師范學院 生命科學學院， 湖北 黃石 435002)

家蠅幼蟲抗菌物質的誘導及抗菌活性研究

潘靈鋒,趙雙雙

(湖北師范學院 生命科學學院， 湖北 黃石 435002)

針刺家蠅三齡幼蟲誘導其體內產生抗菌物質，利用乙酸銨和硫酸銨鹽析方法提取純化家蠅三齡幼蟲體內產生的抗菌物質，并進行抗菌實驗，通過測量其抑菌圈的大小來確定其抑菌能力的強弱。實驗結果顯示：家蠅三齡幼蟲經針刺誘導后能產生抗菌物質; 經初步鑒定該抗菌物質為蛋白質或多肽，且具有熱穩定性。

家蠅幼蟲；針刺；抗菌物質；抑菌圈

家蠅(Musca domestica)隸屬昆蟲綱、雙翅目、環裂亞目、家蠅科,其種類繁多，對人類的危害主要是傳播疾病。研究發現家蠅能攜帶 60多種細菌，一只家蠅的體表可沾有百萬個細菌，最多的可攜帶五億左右個細菌[1～3]。科學家研究發現，家蠅其體表及腹中攜帶數以萬計的細菌、病毒以及寄生蟲卵，但不得病，其原因可能在于家蠅體內能產生多種抗病菌和抗病毒的有效物質[4，5]。本文是以家蠅3齡幼蟲為原材料，采用針刺損傷法誘導，除使原有抗菌蛋白的表達獲得增強外，還激活了新蛋白的產生，這種新蛋白可能也具有抗菌活性。針刺誘導后利用乙酸銨對家蠅3齡幼蟲體內產生的抗菌物質進行提取，并利用提取物作用于細菌培養物，通過測量其抑菌圈的大小來確定其抑菌能力的強弱[6～8]。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1 家蠅幼蟲 采集自野外，經誘集飼料(配方：95%玉米粉 +5%酵母粉，用水拌濕)誘集家蠅產卵，卵孵化后于實驗室飼養，產生3齡幼蟲。

1.1.2 供試微生物 革蘭氏陰性菌：大腸桿菌，革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌(來源于湖北師范學院生命科學學院)。

1.1.3 試劑及溶液 蔗糖、氯化鈉、蛋白胨、酵母提取物、氫氧化鈉、硫酸銨、硫酸銅、乙酸銨。

1)家蠅幼蟲體內抗菌物質提取劑 乙酸銨緩沖液(0.05、0.1、0.2、0.5mol/L)、0.9%的生理鹽水、乙酸銨緩沖液與0.9%的生理鹽水混合液(1∶1).

2)家蠅幼蟲體內抗菌物質純化劑 飽和硫酸銨溶液。

3)家蠅幼蟲體內抗菌物質成分鑒定試劑 10%NaOH溶液、1%CuSO4溶液。

1.1.4 培養基 LB(Luria．Bertani)液體培養基、LB(Luria．Benani)固體培養基、PDA固體培養基、麩皮培養基。

1.2方法

1.2.1 家蠅3齡幼蟲的免疫誘導

1)誘導劑的制備：各取等體積的擴培后的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌液5mL，4，000轉/min，離心5min，棄上清液后，加入1mL的0.9%無菌生理鹽水重新懸浮沉淀，作為誘導劑，4 ℃保存備用。

2)家蠅幼蟲的針刺誘導：取家蠅3齡幼蟲，75%酒精體表消毒后，用蘸取誘導劑的針刺其腹部，將其放置在飼養室內飼養24h，喂食人工飼料(95%玉米粉 和5%酵母粉，并含有相應的誘導源，使其在有誘導源的環境下生長)。

1.2.2 家蠅幼蟲抗菌物質的提取與純化

1)家蠅幼蟲抗菌物質的提取 稱取一定量家蠅3齡幼蟲利用蘸取誘導劑進行針刺，另取等量未經針刺誘導的家蠅3齡幼蟲作為對照，蒸餾水清洗后干燥，分別放入4℃預冷的研缽中，按1∶5的比例(重量體積比)加入相應體積的4℃預冷提取緩沖液。冰浴上充分研磨成漿后，4，000轉/min，離心5min，以去除血細胞和其它組織沉淀，收集上清，并在4℃下保存備用。

2)家蠅幼蟲抗菌物質的純化 利用0.2M的乙酸銨溶液對誘導后的家蠅3齡幼蟲體內的抗菌物質進行提取(粗提取物)，再將獲得的粗提物進行75℃加熱處理， 10000轉/min離心5min，收集上清，緩慢的向上清中加入飽和硫酸銨，攪拌混勻，使其硫酸銨的終濃度達到50%， 4℃冰箱中靜置4 h，10000×g離心5min，取沉淀，再將沉淀溶于0.2M的乙酸銨緩沖液中， 4 ℃，透析袋 (8 000～ 15 000)透析過夜, 將透析好的粗提液4℃下保存備用。

1.2.3 家蠅幼蟲產生抗菌物質的抗菌活性檢測

采用濾紙片法：在平板上貼上1cm左右的無菌濾紙片，然后在濾紙片上點加待測抗菌物質粗提取液50μL，以同體積未經針刺誘導的家蠅3齡幼蟲提取液作為陰性對照，室溫下待樣品完全擴散后，于37度培養箱中培養48h，觀察并測量抑菌圈直徑，并計算抑菌比(用來表明抗菌活性的強弱)。

1.2.4 家蠅幼蟲免疫誘導后產生抗菌物質的初步鑒定

采用雙縮脲反應方法檢測：取一支試管，向試管中加入純化后具有抗菌作用的粗提取液100μL，再滴加10%NaOH溶液10滴及1%CuSO4溶液2滴，混勻，觀察是否出現紫紅色，以確定提取物純化后，溶液中的主要成分為蛋白質。

2 結果

2.1家蠅幼蟲免疫誘導后產生抗菌物質的抑菌活性的檢測

對于利用蘸取誘導劑進行針刺誘導(處理)或未經針刺誘導(對照)的家蠅3齡幼蟲提取液，利用濾紙片法檢測其抑菌效果(見圖1)。

圖1A中：經針刺誘導家蠅幼蟲的提取液對大腸桿菌(G-)的抑菌圈大小(直徑)為13mm(濾紙片大小為11mm)，表明提取液中有抗菌物質產生；

圖1B中：經針刺誘導家蠅幼蟲的提取液對金黃色葡萄球菌(G+)的抑菌圈大小為17mm(濾紙片大小為11mm)，表明提取液中有抗菌物質產生；

圖1C中：未經針刺誘導家蠅幼蟲的提取液對大腸桿菌(G-)的抑菌圈大小為0mm，說明未經針刺誘導家蠅幼蟲的提取液對大腸桿菌(G-)無抗菌效果，表明提取液中無抗菌物質產生；

圖1D中：未經針刺誘導家蠅幼蟲的提取液對金黃色葡萄球菌(G+)的抑菌圈大小為0mm，說明未經針刺誘導家蠅幼蟲的提取液對金黃色葡萄球菌(G+)無抗菌效果，表明提取液中無抗菌物質產生。

濾紙片法抑菌試驗結果顯示家蠅幼蟲經針刺免疫誘導后產生了抗菌物質，該抗菌物質對金黃色葡萄球菌(G+)的抑菌效果比對大腸桿菌(G-)的抑菌效果好。抑菌效果可用抑菌比(抑菌圈的大小/濾紙片大小)來表示(見表1)。

圖1 家蠅幼蟲針刺誘導/未針刺誘導提取液的抑菌效果

A：針刺誘導家蠅幼蟲的提取液對大腸桿菌(G-)的抑菌效果；

B：針刺誘導家蠅幼蟲的提取液對金黃色葡萄球菌(G+)的抑菌效果；

C：未經針刺誘導家蠅幼蟲的提取液對大腸桿菌(G-)的抑菌效果；

D：未經針刺誘導家蠅幼蟲的提取液對金黃色葡萄球菌(G+)的抑菌效果。

表1 家蠅幼蟲針刺誘導/未經針刺誘導提取液的抑菌效果(抑菌比)

2.2家蠅幼蟲免疫誘導后產生抗菌物質的初步鑒定

家蠅幼蟲經免疫誘導后的提取液進行雙縮脲反應，試管中加入純化后的粗提取液，再滴加NaOH溶液后沒有任何現象產生，當加入CuSO4溶液后，上層略顯藍色，下層清澈，當混勻后，可以觀察到溶液由藍色變成紫紅色，其結果表明家蠅幼蟲經免疫誘導后的提取液純化后，溶液中的主要抗菌成分初步鑒定為蛋白質或多肽。

3 分析

1)家蠅3齡幼蟲體內的抗菌物質是在針刺誘導的情況下才大量的表達，該抗菌物質經初步鑒定其主要成分為蛋白質或多肽，對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均具有良好的抗菌作用；

2)本研究以家蠅3齡幼蟲為原材料，利用誘導劑進行針刺誘導，使其體內抗菌基因表達，產出抗菌物質，該抗菌提取物經75℃加熱5min處理后，仍然保持良好的抑菌活性，表明家蠅體內的抑菌物質具有較強的耐熱性；

3)該抗菌物質經初步鑒定其主要成分為蛋白質或多肽，還需通過陽離子交換層析、親和層析進一步純化，通過SDS-PAGE進行相對分子質量的測定，利用IEF-PAGE進行等電點的測定以及凝血活性檢測是否有凝血反應等性質，對具有抗菌活性的蛋白質或多肽進行進一步鑒定，為廣譜抗菌新藥開發打下基礎。

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Keywords: the third instar of housefly；acupuncture；antibiotic substance；inhibition zone

ThestudyfortheinducementofantibacterialsubstancesandtheirantibacterialactivityinMuscadomesticalarvae

PAN Ling-feng , ZHAO Shuang-shuang

(College of Life Sciences, Hubei Normal University, Huangshi 435002,China)

This paper explored the antibiotic substance induced by acupuncture on the third instar of housefly. The method of ammonium acetate and ammonium sulfate was used for purifying the antibiotic substance which produce by the third instar, and antibacterial experiment was conducted after the purification. The bacteriostatic ability was measured by the size of the inhibition zone. The results showed that the antibiotic substance was produced after the induction of acupuncture, and the chemical nature of the antibiotic substance was protein or polypeptides via the preliminary identification.

2014—01—10

潘靈鋒(1991— )，男，湖北黃石人.

Q93

A

1009-2714(2014)02- 0074- 04

10.3969/j.issn.1009-2714.2014.02.017