基于DNA探針和FISH技術(shù)對兩種有害浮游植物的檢測研究

侯建軍，李家園，朱 祎，賀云彥，胡 俊

(1. 湖北師范學(xué)院 污染物分析與資源化技術(shù)湖北省重點實驗室，湖北 黃石 435002； 2. 湖北師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃石 435002；3. 華東師范大學(xué) 河口海岸學(xué)國家重點實驗室，上海 200062)

基于DNA探針和FISH技術(shù)對兩種有害浮游植物的檢測研究

侯建軍1, 2，李家園1, 2，朱 祎2，賀云彥1, 2，胡 俊3

(1. 湖北師范學(xué)院 污染物分析與資源化技術(shù)湖北省重點實驗室，湖北 黃石 435002； 2. 湖北師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃石 435002；3. 華東師范大學(xué) 河口海岸學(xué)國家重點實驗室，上海 200062)

針對兩種典型的有害浮游植物微小原甲藻和Takayamapulchellum(T.pulchellum)各設(shè)計了4條特異性探針，并采用基于PCR管載體的熒光原位雜交檢測方法檢測了這些探針的標(biāo)記效果。實驗結(jié)果表明，針對微小原甲藻和T.pulchellum核糖體大、小亞基DNA(LSU和SSU rDNA)的序列信息所設(shè)計的8條熒光標(biāo)記探針均能夠特異性地識別這些目標(biāo)藻。各探針的標(biāo)記效果有一定差異，經(jīng)過標(biāo)記的目標(biāo)藻細(xì)胞在單種和自然水樣混合樣品中均可以通過熒光顯微鏡進(jìn)行識別和區(qū)分。針對微小原甲藻和T.pulchellum的熒光原位雜交檢測方法的建立將有助于對樣品中這些目標(biāo)藻進(jìn)行快速準(zhǔn)確地檢測和監(jiān)測。

有害浮游植物；寡核苷酸探針；熒光原位雜交；微小原甲藻(Prorocentrumminimum)；Takayamapulchellum

0 前言

分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于鑒定浮游生物種類和解決分類問題。在浮游植物的分類研究中，一般通過對rDNA序列分析來解決分類學(xué)和系統(tǒng)發(fā)生學(xué)的問題。這些序列往往包括核糖體大小亞基(SSU，LSU rRNA)的保守區(qū)和變異區(qū)，從而可以根據(jù)不同保守性設(shè)計出從綱到種甚至株不同分類水平上的寡核苷酸探針[1]。基因數(shù)據(jù)庫的快速擴大，使得在較大范圍內(nèi)對物種進(jìn)行分子鑒定成為可能。目標(biāo)藻與熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交，主要是和靶細(xì)胞中的核糖體RNA發(fā)生結(jié)合，使靶細(xì)胞呈現(xiàn)出綠色的熒光，進(jìn)而通過熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH)進(jìn)行快速鑒定。FISH技術(shù)能用來檢測不同種類的生物，區(qū)分親緣關(guān)系很近、形態(tài)上相似的種或株[2]。目前FISH技術(shù)已經(jīng)成功地應(yīng)用于對有害浮游植物及其它相關(guān)藻類的檢測[3，4]。本研究以筆者相關(guān)的前期工作(如藻種分類及其鑒定)為基礎(chǔ)，開發(fā)針對Takayamapulchellum(T.pulchellum)和微小原甲藻兩種藻華原因種的FISH探針技術(shù)，嘗試對其進(jìn)行快速檢測及現(xiàn)場鑒定。

1 材料與方法

1.1實驗用藻種

目標(biāo)藻微小原甲藻、T.pulchellum和其它用于驗證的藻種均來源于廈門大學(xué)藻種庫(由黃邦欽教授提供)，分屬5個綱，共21種藻株。塔瑪亞歷山大藻、鏈狀亞歷山大藻、亞歷山大藻、微小亞歷山大藻、米氏凱倫藻、T.pulchellum、紅色裸甲藻、無紋環(huán)溝藻、東海原甲藻、微小原甲藻、錐狀施氏藻、中肋骨條藻、擬菱形藻、角毛藻、威氏海鏈藻、扁藻、鹽生杜氏藻、湛江叉鞭金藻、球形棕囊藻、赫氏球石藻、赤潮異彎藻。上述微藻用0.45μm的濾膜過濾人工海水煮沸后配成f/2培養(yǎng)基，在5000LX光強，L∶D=12∶12的光周期和22℃的溫度下進(jìn)行單種培養(yǎng)。

1.2DNA探針的設(shè)計及合成

本實驗?zāi)繕?biāo)藻經(jīng)測序后獲得的序列見表1，將其與從GeneBank和EMBL等核酸數(shù)據(jù)庫種獲得的原甲藻屬所有的株系以及裸甲藻屬所有的株系，連同部分其他甲藻的18S rRNA序列、28S rRNA序列、5.8S rRNA序列以及28S-18S間隔區(qū)序列(ITS)，應(yīng)用Clustal X對序列進(jìn)行排序，并手動精減排列結(jié)果，確定針對目標(biāo)藻分類水平的特異性序列；獲得的探針委托商業(yè)公司大連寶生物合成并進(jìn)行5'端異硫氰酸熒光素FITC熒光基團(tuán)的標(biāo)記。

表1 三種典型甲藻rDNA和轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列號及序列大小

1.3應(yīng)用熒光顯微鏡檢測的熒光原位雜交方法(FISH)

熒光原位雜交的檢測方法根據(jù)文獻(xiàn)[2]進(jìn)行了改進(jìn)。采用鹽乙醇固定法或多聚甲醛固定法，結(jié)合PCR管載體法進(jìn)行雜交。以熒光顯微鏡觀察藻細(xì)胞雜交效果，并記錄陽性標(biāo)記率。用450～490nm的激發(fā)波長、510～520nm發(fā)射波長的濾光片組合觀察。陽性標(biāo)記率以觀察的多個視野中標(biāo)記藻細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例表示[1]。用自然水樣進(jìn)行混和的混合藻樣品和非目標(biāo)藻的全細(xì)胞雜交均采用上述操作方法，同時結(jié)合不同探針的特點，在實驗過程中對藻細(xì)胞通透性、固定條件、藻細(xì)胞內(nèi)殘留色素的脫色條件、雜交溫度、洗滌溫度、雜交緩沖液體的組成和雜交過程進(jìn)行了相應(yīng)完善和優(yōu)化。

2 結(jié)果及分析

2.1寡核苷酸探針的設(shè)計

將GeneBanK中登記的所有原甲藻屬藻株的18S，5.8S，ITS和28S rRNA序列和測序登記的序列進(jìn)行比對分析，對相應(yīng)的保守與變異區(qū)進(jìn)行篩選，我們在18S rRNA，28S rRNA找到了能識別微小原甲藻的特異性探針序列。這些探針對中國的微小原甲藻藻株是保守的，進(jìn)一步分析這些序列的一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)，并結(jié)合軟件計算，從中得到4條適合作為微小原甲藻檢測和鑒定的分子探針DNA序列。PM18S01和PM18S02位于微小原甲藻的18S rRNA上，而PM28S01和PM28S02位于28Sr RNA上。

按照同樣的方法和思路，同樣在18S rRNA和28S rRNA獲得了4條針對T.pulchellum的特異性探針。其中TP18S01和TP18S02位于T.pulchellum的18S rRNA上，TP28S01，TP28S02位于T.pulchellum的28S rRNA上，上述8條探針都能100%地與相應(yīng)的編碼區(qū)配對。陽性探針Euk1209R是針對真核生物18S rRNA設(shè)計，目的是用來摸索雜交條件，并排除靶探針的陰性反應(yīng)不是因為實驗操作和方法引起的。這些寡核苷酸探針的基本信息詳見表2。

2.2熒光顯微鏡觀察全細(xì)胞雜交的結(jié)果

落射熒光顯微鏡觀察到不同探針的標(biāo)記結(jié)果如圖1、圖2所示。可以看出，針對微小原甲藻SSU和LSU rRNA設(shè)計的4條熒光標(biāo)記探針都能夠特異地標(biāo)記目標(biāo)藻(PMXM藻株)細(xì)胞，針對T.pulchellumSSU和LSU rRNA所設(shè)計的4條熒光標(biāo)記探針也都能夠特異性地標(biāo)記目標(biāo)藻TPXM株。高雜交率的探針標(biāo)記細(xì)胞后使細(xì)胞內(nèi)部呈現(xiàn)明亮的綠色熒光，顯示該探針與胞質(zhì)中的rRNA進(jìn)行了很好的結(jié)合，而陰性對照組只呈現(xiàn)出微弱的橙黃色自發(fā)熒光。非目標(biāo)藻除了自發(fā)熒光外，均沒有產(chǎn)生可識別的綠色熒光標(biāo)記信號。與這8條特異性探針相比，針對真核生物設(shè)計的陽性對照探針對所有藻都能產(chǎn)生明顯的綠色陽性熒光標(biāo)記信號。因為沒有單獨設(shè)立陰性探針，在嚴(yán)格的雜交條件下，微小原甲藻和T.pulchellum可互為陰性探針，從而印證了各自探針的特異性。陽性對照探針和互為陰性探針的交叉實驗，以及對目標(biāo)藻和非目標(biāo)藻雜交結(jié)果的比較證明了我們所設(shè)計的8條探針的特異性較好，但標(biāo)記識別效果存在差異。

表2 FITC標(biāo)記用于原位雜交的寡核苷酸探針

圖1 微小原甲藻和不同探針進(jìn)行全細(xì)胞熒光雜交的落射熒光顯微鏡圖片

圖2 T. pulchellum和不同探針進(jìn)行全細(xì)胞熒光雜交的落射熒光顯微鏡圖片

2.3混合藻種樣品的全細(xì)胞熒光雜交

為了進(jìn)一步驗證靶探針從模擬自然混合樣品中識別目標(biāo)藻的能力，在純種藻株的全細(xì)胞熒光雜交的基礎(chǔ)上，選用陽性雜交率高的探針對多種非目標(biāo)藻配制的混合藻種樣品進(jìn)行檢測，進(jìn)一步探討特異性探針對目標(biāo)藻的識別效果。

圖3 混合樣品與微小原甲藻特異性探針全細(xì)胞雜交的綠色熒光信號

圖4 混合樣品與T. pulchellum特異性探針全細(xì)胞雜交的綠色熒光信號

圖3中，PM28S02能較好地從東海原甲藻、紅色裸甲藻、湛江叉鞭金藻中將微小原甲藻進(jìn)行特異性標(biāo)記，憑借熒光顯微鏡下FITC的綠色熒光，容易將目標(biāo)藻從混合藻樣品中分辨出來，而陽性探針Euk1209R均能使所有的藻細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光；同樣，PM28S02，PM28S01和PM18S02探針也能從混合有塔瑪亞歷山大藻、米氏凱倫藻、T.pulchellum、錐狀施氏藻的樣品中將微小原甲藻進(jìn)行識別。這些混合樣品中添加了1/3體積左右的目標(biāo)藻。從圖4中也可以看出，TP18S02能從混合樣品T.pulchellum、東海原甲藻、紅色裸甲藻、湛江叉鞭金藻中將T.pulchellum進(jìn)行識別，TP18S02，TP18S01，TP28S01同樣也能將T.pulchellum從塔瑪亞歷山大藻、米氏凱倫藻、錐狀施氏藻、微小原甲藻等組成的混合樣品中標(biāo)記識別出來。陰性對照組無綠色熒光，Euk1209R則使所有藻株均能標(biāo)記上綠色熒光。

2.4探針檢測及計數(shù)結(jié)果與細(xì)胞生理狀態(tài)的關(guān)系

從探針的檢測應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，特異性探針的雜交率與目標(biāo)藻的生長狀態(tài)密切相關(guān)。當(dāng)目標(biāo)藻處于指數(shù)生長期，雜交后的熒光信號較強，相應(yīng)的雜交率也高；當(dāng)藻細(xì)胞處于穩(wěn)定生長期時，雜交后的熒光強度較弱。

圖5 不同細(xì)胞密度的Prorocentrum minimum樣品用明視野計數(shù)、DAPI染色計數(shù)和PM28S02探針計數(shù)之間的關(guān)系

圖6 不同細(xì)胞密度的T. pulchellum樣品用明視野計數(shù)、DAPI染色計數(shù)和TP18S02探針計數(shù)之間的關(guān)系

用雜交率較好的PM28S02探針對純培養(yǎng)微小原甲藻的雜交計數(shù)結(jié)果與DAPI計數(shù)結(jié)果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，雖然PM28S02的計數(shù)與明視野計數(shù)有較好的相關(guān)關(guān)系(r2=0.8586，p<0.01)，但DAPI計數(shù)結(jié)果更接近顯微鏡的明視野(r2=0.9678，p<0.001).與此相似，高雜交率的TP18S02對T.pulchellum的計數(shù)結(jié)果與明視野計數(shù)的關(guān)系相關(guān)性為：r2=0.8974，p<0.01，而DAPI計數(shù)結(jié)果與明場下計數(shù)的關(guān)系為：r2=0.9253，p<0.01.表明DAPI的計數(shù)結(jié)果較探針更接近顯微鏡明場下的計數(shù)。具體情況詳見圖5、圖6.

3 討論

3.1熒光原位雜交的特點適于對有害藻進(jìn)行檢測和鑒定

分子探針技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于對浮游植物種系進(jìn)化關(guān)系、疑似藻種定性定量檢測、有害藻類產(chǎn)毒特征與微生物的關(guān)系研究等方面[4，5]。原位熒光雜交技術(shù)不破壞細(xì)胞形態(tài)，通過增強細(xì)胞膜的通透性，使探針方便地進(jìn)入細(xì)胞，與目標(biāo)序列進(jìn)行雜交。建立針對典型有害生物微小原甲藻和T.pulchellum的熒光原位雜交技術(shù)及檢測方法將為實現(xiàn)快速準(zhǔn)確監(jiān)測和研究這些有害有毒藻提供適用的技術(shù)和方法，為這些探針在浮游植物分子鑒定中的有效應(yīng)用提供基礎(chǔ)。針對微小原甲藻和T.pulchellum建立的雜交體系和檢測方法較為可靠且可行。

3.2特異性探針的設(shè)計及其驗證與有效檢測目標(biāo)藻的關(guān)系

實驗將測序獲得的兩種藻基因序列與GeneBank中其它種的基因型序列進(jìn)行了細(xì)致比對，以18S rRNA以及28S rRNA作為目標(biāo)序列，從序列間差異較大區(qū)域找到了特異性的探針位置。我們沒有在ITS區(qū)域設(shè)計探針。一般在保守區(qū)和高變區(qū)相互鑲嵌的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)是核苷酸替換速率較高的區(qū)域，國際上曾公認(rèn)其為屬下種間水平的一個很好的分子標(biāo)記。如陳月琴等[7]認(rèn)為亞歷山大藻ITS可適用于設(shè)計鑒定不同的種甚至不同地理株系的探針。但Adachi等[8]1996年曾針對日本的塔瑪亞歷山大藻和鏈狀亞歷山大藻的ITS區(qū)設(shè)計了特異性探針，實驗結(jié)果顯示這些探針只與DNA雜交，雖然特異性尚好，但雜交后的效果欠佳。對塔瑪亞歷山大藻的研究結(jié)果也表明針對ITS區(qū)域設(shè)計的探針雜交效果較差[1]。原因在于ITS序列定位于染色體DNA的RNA基因中或基因轉(zhuǎn)錄的前體RNA，相對于核糖體而言其在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)較少，同時也受細(xì)胞生理狀態(tài)的影響。本實驗結(jié)果所示，不同的探針雜交率和標(biāo)記效果有一定差異。這可能與探針靶序列附近有影響探針雜交的二級結(jié)構(gòu)有關(guān)。雖然有時探針不能和RNA發(fā)生結(jié)合，但也能與rDNA結(jié)合產(chǎn)生較弱的熒光雜交信號。設(shè)計輔助探針有助于解決二級結(jié)構(gòu)妨礙雜交的問題[1]。

另外，本研究的探針是針對兩種常見的有害藻微小原甲藻和T.pulchellum設(shè)計的，探針的通用性還需要通過對更多目標(biāo)藻進(jìn)行驗證來確定，要交叉排除更多非目標(biāo)藻來印證其特異性。生物物種的遺傳多樣性和探針的特異性往往存在矛盾，不同地域的相同種可能在基因序列上存在一定的差異，因此沒有全球通用的某種浮游植物的特異性探針[9]。特異性探針開發(fā)完善之前，對世界范圍內(nèi)微藻進(jìn)行多樣性篩查十分必要。構(gòu)建其它浮游植物探針也一樣，必需系統(tǒng)分析目標(biāo)藻及近緣種的核糖體大亞基，5.8S核糖體小亞基和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)等的序列信息，從而有針對性的獲得相應(yīng)的探針并建立基于這些探針的FISH方法，才有可能保證這些探針在實際檢測和應(yīng)用中的特異性和準(zhǔn)確性。

3.3影響熒光原位雜交率和檢測靈敏度的因素分析

探針的雜交效果受細(xì)胞生理狀態(tài)的影響。從兩種藻明視野、探針計數(shù)和DAPI計數(shù)的關(guān)系也可以看出來。明視野下計數(shù)不能區(qū)分細(xì)胞的生理狀態(tài)，如死細(xì)胞和不同生理狀態(tài)的細(xì)胞。而DAPI計數(shù)能區(qū)分死、活的細(xì)胞，但不能區(qū)分不同生理狀態(tài)的細(xì)胞。所以導(dǎo)致不同的計數(shù)結(jié)果出現(xiàn)這樣一種排列情況：明視野計數(shù)>DAPI計數(shù)>探針計數(shù)。這種情況與細(xì)胞質(zhì)中核糖體RNA的拷貝數(shù)有關(guān)[10]。細(xì)胞旺盛生長時，核糖體RNA合成顯著增長，在細(xì)胞生長的穩(wěn)定期和停滯期，核糖體RNA合成迅速減少，導(dǎo)致核糖體拷貝數(shù)大大降低。當(dāng)RNA含量低到一定程度時，熒光顯微鏡或者流式細(xì)胞儀則不能有效地將其檢測出來。同時，探針的檢測靈敏度也和細(xì)胞生理狀態(tài)有關(guān)。雖然理論上分子探針的檢測靈敏度可達(dá)到0.043%[9]。但在實際操作中，細(xì)胞的生理狀態(tài)，衰老細(xì)胞和死細(xì)胞的內(nèi)含物，色素團(tuán)會掩蔽探針的雜交效果。藻色素的紅色或黃色自發(fā)熒光也會干擾對探針的熒光分辯。供檢測的樣品最好是處在最佳生長狀態(tài)的樣品，檢測結(jié)果也只適合對細(xì)胞生長處于旺盛期的樣品進(jìn)行解釋[11]。在探針的設(shè)計方面，還可以考慮添加無標(biāo)記的輔助探針，與相應(yīng)的序列發(fā)生結(jié)合后會改變RNA的二級結(jié)構(gòu)，可使熒光標(biāo)記探針的靶序列暴露出來從而易于與探針發(fā)生特異性結(jié)合[1]。酪胺信號放大技術(shù)也可以顯著提高雜交信號強度[12]。雖然特異性探針的雜交率很高，如果要對現(xiàn)場樣品進(jìn)行檢測，多次離心操作會使目標(biāo)藻細(xì)胞產(chǎn)生損失，影響探針計數(shù)的準(zhǔn)確性。這些技術(shù)優(yōu)化集成后，可以讓缺乏藻類分類學(xué)知識和背景的環(huán)境檢測部門工作人員或者環(huán)保志愿者能方便地對水環(huán)境中的有害浮游植物進(jìn)行快速準(zhǔn)確地檢測和鑒定。

在未來的研究中，我們擬進(jìn)一步把成熟的、能夠應(yīng)用于快速檢測粒徑較大藻類的分子探針檢測技術(shù)優(yōu)化，結(jié)合酪胺信號放大技術(shù)，使其能夠用于檢測難度更大的10μm或者更小粒徑如超微型浮游植物的檢測上，從而把有關(guān)工作進(jìn)一步推向深入。

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IdentificationoftwospeciesofharmfulphotoplanktonusingfluorescenceinsituhybridizationandDNAprobes

HOU Jian-jun1, 2, LI Jia-yuan1, 2ZHU Yi1，2, HE Yun-yan1, 2, HU Jun3

(1. Hubei Key Laboratory of Pollutant Analysis &Reuse Technology, Huangshi 435002,China;2. College of Life Science, Hubei Normal University, Huangshi 435002,China;3. State Key Laboratory of Estuarine and Coastal Research,East China Normal University, Shanghai 200062,China)

Four specific DNA probes were designed to identifyProrocentrumminimumandTakayamapulchellumtwo harmful phytoplankton, and fluorescenceinsituhybridization probes based on PCR tube carriers were developed. Epifluorescence micrographs showed that these specific probes labeled with fluorescein isothiocyanate can identified target sequences, and the fluorescence signal resulted from whole-cell hybridization presented differences. The hybridization cell can be identified in pured and mixed natural algal samples. The results suggested that method ofP.minimumandT.pulchellumfluorescence in situ hybridization based DNA probes could achieve fast and accurately detection of target algaes.

harmful phytoplankton;oligonucleotide probes;fluorescenceinsituhybridization (FISH);prorocentrumminimum;Takayamapulchellum

2013-09-30

國家自然科學(xué)基金資助項目(編號: 41171045 )、淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點實驗室開放課題(編號：2008FB005)；農(nóng)業(yè)部淡水魚類種質(zhì)資源與生物技術(shù)重點實驗室開放課題(編號：LFB20070611)、教育部博士點基金項目(編號: 20070504076)、黃石市2010年度科技計劃項目(編號：2010A1019-7)、湖北師范學(xué)院2008年度校級創(chuàng)新團(tuán)隊項目，湖北師范學(xué)院研究生創(chuàng)新基金項目(編號：201204)資助。

侯建軍(1966— )，男，湖北恩施人，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事水生生物學(xué)的教學(xué)與科研工作.

X171

A

1009-2714(2014)01- 0020- 07

10.3969/j.issn.1009-2714.2014.01.005