人乳頭瘤病毒E6/E7 mRNA檢測在宮頸病變篩查中的應用價值

張生枝,邵華江,馬建婷

(1.寧波大學醫學院，浙江 寧波315211；2.寧波大學醫學院附屬陽明醫院 婦產科，浙江 余姚315400)

眾所周知，人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是宮頸癌發生和發展的首要因素。近年來，HPV DNA聯合細胞學檢測用于宮頸病變的篩查，顯著降低了宮頸癌的發生率，但HPV DNA只是病因檢測，對病毒的活動程度及病變程度無法判斷，從而使其不能預測宮頸病變的進展及進行風險評估。由于E6和E7是HPV的癌基因，其表達產物E6和E7蛋白是致癌的關鍵，因而E6/E7 mRNA體現了HPV致癌基因活動程度。本研究對TCT剩余標本行HPV E6/E7 mRNA檢測，與HPV DNA檢測進行比較，以探討其在宮頸病變篩查中的應用價值。

1 材料與方法

1.1一般資料

2012年6月至2013年4月在余姚市人民醫院因宮頸炎癥、陰道異常出血或排液門診患者720例，年齡23-80歲，平均年齡43.7歲。均有性生活史，無宮頸物理治療及手術史，無盆腔放射史，均排除妊娠，3d內無陰道沖洗及用藥。以病檢結果正常、炎癥、CIN1患者為對照組，CIN2+(CIN2、CIN3、宮頸癌)患者為觀察組。

1.2方法

1.2.1 TCT檢查 采用TCT專用毛刷取材，將宮頸管內和鱗柱上皮交界處采集的細胞涮洗在TCT專用取樣瓶中，經TCT專用制片機制成薄層涂片，經巴氏染色后鏡檢。宮頸細胞學診斷按照國際癌癥協會推薦的TBS(2001)分類法。

1.2.2 HPV DNA檢測 采用PCR反向點雜交技術。所用HPV專用毛刷、細胞保存液、試劑盒和儀器均購自深圳亞能生物技術有限公司。采用HPV專用毛刷取材，將鱗柱上皮交界處和宮頸管采集的細胞涮洗在HPV專用取樣瓶中。嚴格按照試劑盒說明進行操作。

1.2.3 組織病理學檢查 TCT≥ASC-US或(和)高危HPV DNA陽性的患者行HPV E6/E7 mRNA檢測和陰道鏡下宮頸活檢。宮頸組織病理學診斷分為：正常或炎癥、宮頸上皮內瘤變(CIN)、浸潤癌(ICC)。對病檢結果≥CIN1的患者行子宮頸電環切除(LEEP)或冷刀錐切術(CKC)，以獲取進一步病理診斷。若不同部位有不同級別診斷，以病理級別最高者作為最后診斷。

1.2.4 HPV E6/E7 mRNA檢測 采用TCT剩余標本，試劑盒和儀器均購自河南中美合資科蒂亞生物技術有限公司(Kodia Biotechnology Inc)。實驗人員只記錄標本編號，事先不知曉標本診斷，嚴格按照試劑盒說明進行操作。加入試劑處理后的標本采用QuantiVirusTM冷光儀檢測。檢測結果為光子數，經計算軟件轉換為拷貝數，≥1copy/ml為陽性。

1.3統計學方法

采用SPSS 13．0軟件，計數資料用χ2檢驗；以受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)作為評價篩查方法的準確性，ROC曲線采用MedCalc分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1TCT、HPVDNA、HPVE6/E7mRNA及病理檢查結果

720名患者中，TCT結果為NILM者531例(73.8%)，ASC-US 80例(11.1%)，LSIL 44例(6.1%)，ASC-H 9例(1.3%)，HSIL 54例(7.5%)，AGC 2例(0.3%)，；HPV DNA陽性者254例(35.3%)，其中高危型HPV(HR-HPV)陽性者243例，低危HPV(LR-HPV)陽性者11例；TCT≥ASC-US或(和)HR-HPV DNA陽性者274例，均行宮頸HPV E6/E7 mRNA檢測和病理學檢查。病檢結果與TCT、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測結果關系見表1。

表1 病檢結果與 TCT、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測結果關系[ n(%)]

注：≥ASC-H包括ASC-H、HSIL、AGC、宮頸癌。

在CIN和ICC中，HPV E6/E7 mRNA總體陽性率為78.7%(170/216)，低于HPV DNA總體陽性率92.6%(200/216)，差異有統計學意義(χ2=16.949，P<0.001)。從表1可見，隨著宮頸病變級別的升高，HPV E6/E7 mRNA陽性率也隨之升高，差異有統計學意義(χ2=12.851，P<0.01)。但在CIN2+(CIN2、CIN3、ICC)中，HPV E6/E7 mRNA陽性率差異無統計學意義(χ2=1.435，P>0.05)。

2.2HPVE6/E7mRNA、HPVDNA檢測對CIN2+的診斷結果及診斷價值

見表2、表3。HPV E6/E7 mRNA檢測診斷CIN2+的靈敏度為83.0%，低于HPV DNA(94.5%)，差異有統計學意義(χ2=10.994，P<0.01)；特異度為51.1%，高于HPV DNA(22.8%)，差異有統計學意義(χ2=14.579，P<0.001)；陽性預測值為77.0%，高于HPV DNA(70.8%)，但差異無統計學意義(χ2=1.876，P>0.05)；陰性預測值為60.3%，低于HPV DNA(67.7%)，差異也無統計學意義(χ2=0.259，P>0.05)。

2.3HPVE6/E7mRNA、HPVDNA檢測診斷CIN2+的ROC曲線，

見圖1。對于診斷CIN2+，HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA的ROC曲線下面積分別為0.670(95%可信區間0.611～0.726)、0.587(95%可信區間0.526～0.646)。經Z檢驗，差異有統計學意義(Z=3.165，P<0.01)，可見，HPV E6/E7 mRNA檢測診斷CIN2+的準確性高于HPV DNA檢測，但兩者準確性均較低。

表2 HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA檢測與病理檢查診斷結果

表3 HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA檢測對CIN2+的診斷價值

圖1 HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA檢測診斷CIN2+的ROC曲線

3 討論

宮頸癌是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，高危型HPV持續感染是宮頸癌發生發展的首要因素。Walboomers等[1]研究發現，幾乎100%宮頸癌標本中可檢測到HPV，可見HPV檢測對宮頸癌篩查有重要意義。2003年美國食品與藥品管理局(FDA)批準HPV檢測聯合細胞學檢查用于30歲以上婦女的宮頸癌篩查。但HPV DNA檢測只是病因學診斷，不能判斷宮頸HPV感染階段以及病毒癌基因的活性。因此，需采取更為有效的HPV檢測進行宮頸癌的早期篩查。

HPV早期編碼區中E6、E7基因是病毒癌基因，病毒DNA一旦整合進入宿主細胞DNA，E6、E7基因將不受控制地高度表達，增加到引起宮頸細胞惡化的水平[2]。E6、E7基因的轉錄產物E6/E7 mRNA反映了癌基因活性，通過對E6/E7 mRNA檢測，不必重復進行HPV檢測即能判斷HR-HPV反復感染[3]。研究證實E6/E7 mRNA表達是宮頸癌發生發展的必經步驟，2006年歐洲生殖器感染和腫瘤研究組織(European Research Organization on Genital Infection and Neoplasia，EUROGIN)取得了共識，認為HPV E6/E7 mRNA檢測應作為重點研究對象[4]。Ratman等[5]研究發現隨著宮頸病變的加重，HPV E6/E7 mRNA陽性率也隨之增加。本研究發現HPV E6/E7 mRNA在CIN1、CIN2、CIN3、ICC中陽性率分別為55.9%、80.0%、83.6%、89.7%，差異有統計學意義(P<0.01)；但在CIN2+中，HPV E6/E7 mRNA陽性率差異無統計學意義，這與Shen[6]等報道一致，但與Szarewski等[7]報道不一致。由于CIN2、CIN3常作為高級別宮頸上皮內病變，需要有創操作進行干預[4]，因而本研究以CIN2+作為宮頸病變的研究對象。對于診斷CIN2+，本研究發現HPV E6/E7 mRNA特異度(51.1%)高于HPV DNA(22.8%)，差異有統計學意義(P<0.01)，且通過ROC曲線分析，其準確性也高于HPV DNA(P<0.01)，可見HPV E6/E7 mRNA檢測較HPV DNA更精準、更直接，可以更為準確地篩選出高危人群以及監測宮頸病變的發生發展。但HPV E6/E7 mRNA靈敏度為83.0%，漏診率為17.0%，且其對診斷CIN2+準確性仍欠理想，因此，筆者并不建議其單獨應用于宮頸癌的篩查，可考慮將其與細胞學聯合檢測或將其作為二線篩查手段。Cattani等[2]研究表明宮頸脫落細胞HPV E6/E7 mRNA檢測可評估宮頸病變進展風險，本研究中18例HR-HPV DNA陽性而細胞學正常的患者中檢測到E6/E7 mRNA，表明E6/E7 mRNA在宮頸細胞發生改變前就已經有表達，比細胞學能更早預測病變進展的風險。但是，對于HR-HPV DNA與HPV E6/E7 mRNA陽性患者病變進展風險大小如何仍有待于大樣本隨機對照試驗的研究。

本研究發現HPV E6/E7 mRNA在CIN和宮頸癌中的陽性率(78.7%)低于HPV DNA(92.6%)，有31例HR-HPV DNA陽性的CIN1、CIN2患者未檢測到E6/E7 mRNA，因大部分CIN1可自行逆轉，盡管大部分CIN2向更高級別病變發展，但仍有32%CIN2會自行消退[8]，因而，E6/E7 mRNA陰性可能預示著疾病逆轉。但另一方面，宮頸HPV感染到發生宮頸癌是一個漫長的過程，在這過程中，HPV可能處于靜止期，出現病毒癌基因低轉錄或無轉錄。因而，對于HPV DNA陽性、E6/E7 mRNA陰性患者仍需長期隨訪觀察。

早期用于HPV E6/E7 mRNA商業化臨床檢測技術有Aptima技術、PreTect HPV - Proofer技術和NucliSENS Easy Q技術，其中Aptima技術于2011年通過了FDA的認證。本研究采用的Quantivirus○R技術為近幾年興起的商業化檢測技術，其原理為支鏈DNA(bDNA)技術，可同時檢測HR-HPV 13種亞型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)和LR-HPV 6種亞型(6、11、40、42、43、44)。由于本研究樣本例數有限，該方法對E6/E7 mRNA的檢測價值尚有待進一步研究，尤其是對于HR-HPV和HPV E6/E7 mRNA均陽性而陰道鏡下活檢正常的患者更需進行隨訪觀察。

作者簡介：張生枝(1987-)，女，碩士研究生，主要研究方向：婦科腫瘤；邵華江，男，寧波大學醫學院附屬陽明醫院婦產科主任，主任醫師，教授，碩士生導師。

參考文獻：

[1] Walboomers JMM,Jacobs MV,Manos MM,et al.Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide[J].The Journal of pathology,1999,189(1):12.

[2]Cattani P,Siddu A,D'Onghia S,et al.RNA (E6 and E7) assays versus DNA (E6 and E7) assays for risk evaluation for women infected with human papillomavi rus[J].Journal of clinical microbiology,2009,47(7):2136.

[3]Keegan H,Mc Inerney J,Pilkington L,et al.Comparison of HPV detection technologies:Hybrid capture 2,PreTect? HPV-Proofer and analysis of HPV DNA viral load in HPV16,HPV18 and HPV33 E6/E7 mRNA positive specimens[J].Journal of Virological Methods,2009,155(1):61.

[4]Cuschieri K,Wentzensen N.Human papillomavirus mRNA and p16 detection as biomarkers for the improved diagnosis of cervical neoplasia[J].Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention,2008,17(10):2536.

[5]Ratnam S,Coutlee F,Fontaine D,et al.Clinical performance of the PreTect HPV-Proofer E6/E7 mRNA assay in comparison with that of the Hybrid Capture 2 test for identification of women at risk of cervical cancer[J].Journal of clinical microbiology,2010,48(8):2779.

[6]Shen Y,Gong J,He Y,et al.Quantivirus? HPV E6/E7 RNA 3.0 Assay (bDNA) is as sensitive,but less specific than Hybrid Capture 2 Test[J].Journal of virological methods,2012,187(1):288.

[7]Szarewski A,Mesher D,Cadman L,et al.Comparison of seven tests for high-grade cervical intraepithelial neoplasia in women with abnormal smears:the Predictors 2 study[J].Journal of clinical microbiology,2012,50(6):1867.

[8]Holowaty P,Miller AB,Rohan T,et al.Natural history of dysplasia of the uterine cervix[J].Journal of the National Cancer Institute,1999,91(3):252.