銅綠假單胞菌的臨床分布及對環(huán)丙沙星耐藥機制的研究

黃興富,范 華

(聊城市東昌府人民醫(yī)院 檢驗科,山東 聊城252000)

銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa,PAE)是一種常見的革蘭氏陰性桿菌,可存在于人體皮膚、呼吸道、消化道等部位,是臨床最常見的條件致病菌[1]。由于抗生素及免疫抑制劑等藥物的濫用,易引發(fā)機體菌群失調(diào),導(dǎo)致銅綠假單胞菌感染致病；同時增強了病原菌的耐藥性,使得臨床治療困難重重。了解銅綠假單胞菌的臨床感染分布及耐藥性特點可以更好的指導(dǎo)臨床合理用藥,控制醫(yī)院感染。本研究對我院2011年9月-2013年9月收集的287株銅綠假單胞菌陽性標本的分布及耐藥情況進行分析,并初步探討了銅綠假單胞菌對環(huán)丙沙星抗菌藥物的耐藥機制,以期對臨床合理用藥提供一定的指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1菌株來源收集了2011年9月-2013年9月我院各種臨床樣本分離的銅綠假單胞菌共287株。全部菌株通過法國梅里埃公司VITEK-32細菌鑒定儀進行鑒定。

1.2藥敏試驗采用瓊脂紙片擴散法(K-B法)進行藥敏試驗,結(jié)果以美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)公布的標準判定。并采用微量肉湯稀釋法測定環(huán)丙沙星對PAE的最低抑菌濃度(MIC)。M-H瓊脂及抗菌藥物紙片均是英國Oxoid公司產(chǎn)品。以標準質(zhì)控菌株銅綠假單胞菌(ATCC27853)、大腸埃希菌(ATCC25922)作為質(zhì)控菌株。

1.3基因突變分析對gyrA、gyrB、parC及parE基因喹諾酮類耐藥決定區(qū)(QRDR)的突變進行檢測。采用煮沸法提取細菌總的DNA作為PCR模版。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min、94 ℃變性45s、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min,25個循環(huán)、72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。gyrA、gyrB、parC及parE特異性引物的合成及PCR產(chǎn)物的測定均由生工生物工程(上海)有限公司代為完成,所設(shè)計的引物序列如下：gurA上游：ATCACTACGGTGGCTCATTT,下游：CTTCGGTACCGTGAAGAAGA,擴增片段長度為910 bp；gyrB上游：GAAGTTCACTTCAAGCCGTC,下游：AGGAGAGCATCTTGTCGAAG,擴增片段長度為895bp；parC 上游：TCCAAAGTTCGCGGAATCCA,下游：ATCACTTAACCGGCTGGACG,擴增片段長度為398 bp；parE上游：GCATCCGCGAGGATACAGAT,下游：AGTCGGTGCAGGAAAGCTAC,擴增片段長度為691 bp。基因組提取試劑盒購自北京TIAGEN生化科技有限公司；PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。

1.4統(tǒng)計分析采用SPSS16.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1臨床標本來源及科室分布287株銅綠假單胞菌的標本主要來源是痰液,共219例,占76.3%；其它標本依次為膿液22例,占7.7%；分泌物18例,占6.3%；尿液13例,占4.5%；血液8例,占2.8%；其他標本7例,占2.4%。而在臨床科室中的分布ICU和呼吸內(nèi)科依然是銅綠假單胞菌感染最多的2個科室,分別占29.3%和22.6%,在其他科室分布依次為心內(nèi)科40株,占13.9%；骨科23株,占8.0%；神經(jīng)內(nèi)科18株,占6.3%；腦外科17株,占5.9%；腎內(nèi)科14株,占4.9%；消化內(nèi)科10株,占3.5%；血液科7株,占2.4%；其他科室9株,占3.1%。

2.2耐藥性分析287株銅綠假單胞菌對7種臨床常用抗菌藥的耐藥性分析見表1。銅綠假單胞菌對亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦及頭孢他啶敏感率均在70%以上；其次較為敏感的為氨曲南及頭孢吡肟,敏感率在60%以上；而對環(huán)丙沙星耐藥率較高,達44.9%,對氨芐西林的耐藥率甚至高達97.9%。

表1 287株銅綠假單胞菌對7種抗菌藥的耐藥性分析

2.3基因突變檢測對129株環(huán)丙沙星耐藥的銅綠假單胞菌進行MIC檢測,發(fā)現(xiàn)MIC≥32 μg/ml的菌株有45株,對此45株銅綠假單胞菌的gyrA、gyrB、parA及parE的QRDR進行PCR擴增及測序,結(jié)果發(fā)現(xiàn),僅3株無任何基因突變,剩余42株均存在gyrA基因突變,且其中32株存在著雙突變,以gyrA基因和parC基因同時突變最多,有28例。詳見表2。

表2 45株環(huán)丙沙星耐藥銅綠假單胞菌的QRDR錯義突變分析

3 討論

銅綠假單胞菌是目前醫(yī)院感染常見的條件致病菌,可導(dǎo)致呼吸道、泌尿道和血液的感染[2-3],在醫(yī)院感染占有重要地位[4],且其感染率近年來不斷增加[5]。分析本院2011年9月-2013年9月收集的各科室共287株銅綠假單胞菌的臨床分布及耐藥情況,標本來源從多到少依次為痰液、膿液、分泌物、尿液和血液,其中痰液占了標本總數(shù)的76.3%。銅綠假單胞菌陽性標本的臨床科室分布以ICU(29.3%)及呼吸內(nèi)科(22.6%)居多,其次為心內(nèi)科(13.9%)及骨科(8.0%)等科室。考慮ICU及呼吸內(nèi)科患者多為老年病人,患者病程長、病情重、機體免疫力低下,在對重癥患者進行搶救時常進行氣管切開及插管等侵入性操作,同時這些患者往往伴有長時間的使用廣譜抗菌藥控制感染,極易引發(fā)機體菌群失調(diào)進而導(dǎo)致條件致病菌如銅綠假單胞菌感染增加。

銅綠假單胞菌具有多種獲得性耐藥機制,并且具有耐藥性強和機制復(fù)雜的特性,同時也具有較強的環(huán)境適應(yīng)能力[6]。本研究對7種臨床常用的抗菌藥耐藥性分析顯示銅綠假單胞菌對亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦及頭孢他啶敏感率均在70%以上；其次較為敏感的為氨曲南及頭孢吡肟；而對環(huán)丙沙星耐藥率較高,達44.9%,對氨芐西林幾乎全部耐藥。銅綠假單胞菌的耐藥機制復(fù)雜,主要涉及膜孔蛋白丟失、外排泵系統(tǒng)、整合子系統(tǒng)、基因盒和β-內(nèi)酰胺酶等,導(dǎo)致臨床治療困難,目前抗菌藥應(yīng)用廣泛,助長了細菌產(chǎn)生更強的耐藥性。本研究結(jié)果與國內(nèi)一些報道相似[5-7],同時存在差異,郭麗等[8]研究分析顯示銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥率為39.8%,明顯高于我們的分析結(jié)果。碳青霉烯類抗菌藥物是治療銅綠假單胞菌的最有效藥物之一,亞胺培南為此類抗菌藥的代表性藥物,有研究顯示銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥率在逐年增加[9],高輝等[5]對某醫(yī)院2005年-2009年銅綠假單胞菌的耐藥性分析顯示5年內(nèi)PAE對碳青霉烯類、β-內(nèi)酰胺類、磺胺類、喹諾酮類等多種抗菌藥的耐藥性均有不同程度的增加趨勢。提示目前細菌耐藥問題日趨嚴重,臨床醫(yī)師應(yīng)當合理用藥,規(guī)范用藥,防止細菌耐藥性持續(xù)升高。

由于銅綠假單胞菌對青霉素類藥物耐藥機制已相對明確,本研究僅對環(huán)丙沙星的耐藥機制進行初步研究。通過PCR擴增及測序的方法對目的菌株的gyrA、gyrB、parC及parE基因喹諾酮類耐藥決定區(qū)(QRDR)的突變進行檢測,在45株(環(huán)丙沙星MIC≥32 μg/ml)銅綠假單胞菌中,發(fā)現(xiàn)有42株均存在gyrA基因突變,且主要突變位點是第83位密碼子(ACC->ATC,Thr-83->Ile),說明了gyrA基因的錯義突變與對環(huán)丙沙星耐藥密切相關(guān)；而MIC范圍在128到256的銅綠假單胞菌株,大部分都存在gyrA與parC雙突變,從而說明parC基因突變能進一步提高銅綠假單胞菌對環(huán)丙沙星的耐藥性。但本研究未發(fā)現(xiàn)文獻報道的gyrA基因第87位密碼子單突變及83、87位密碼子雙突變菌株[10]。此外,還有3株銅綠假單胞菌未發(fā)現(xiàn)上述基因的QRDR錯義突變,提示銅綠假單胞菌對環(huán)丙沙星的耐藥情況還存在著其他機制,如主動外排系統(tǒng)的過度表達及膜滲透性的下降等。

細菌的耐藥性問題已成為我國顯著存在的醫(yī)療衛(wèi)生及經(jīng)濟性問題[11]。抗菌藥的不合理應(yīng)用與菌株的耐藥性升高直接相關(guān),這應(yīng)引起各級醫(yī)師的高度重視,做到定期監(jiān)測本地區(qū)常見病原菌的臨床分布和耐藥性變化,根據(jù)監(jiān)測結(jié)果合理選用抗菌藥,更好的遏制菌株的耐藥率,提高治療療效。

作者簡介：黃興富(1976),男,學(xué)士,主管檢驗師,主要從事臨床檢驗工作。

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