血管性認知障礙大鼠學習記憶、血清EPCs、NO、VEGF變化及電針的干預作用

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(1.安徽醫學高等?？茖W校，合肥 230601；2.安徽中醫藥大學第二附屬醫院，合肥 230061；3.安徽中醫藥大學，合肥 230038)

·實驗研究·

血管性認知障礙大鼠學習記憶、血清EPCs、NO、VEGF變化及電針的干預作用

錢善軍1,陳幸生2*,周婷2,程紅亮2,張聞東2,李飛2,蔡榮林3,吳生兵3,陳國慶3,王儲蓄3,何俊良3

(1.安徽醫學高等?？茖W校，合肥 230601；2.安徽中醫藥大學第二附屬醫院，合肥 230061；3.安徽中醫藥大學，合肥 230038)

目的 觀察電針對血管性癡呆(VD)大鼠學習記憶、內皮祖細胞(EPCs)數量、氧化亞氮(NO)及血管內皮生長因子(VEGF)的影響。方法 四血管阻斷制作VD模型大鼠,水迷宮檢測大鼠學習記憶能力、流式細胞術檢測外周血內皮祖細胞(EPCs)數量、ELISA放射免疫法檢測VEGF含量、硝酸還原酶法檢測NO并與茴拉西坦對照。結果 與空白對照組比較，電針能夠改善血管性認知障礙大鼠的學習記憶能力，提高外周血血管內皮祖細胞的數量，升高血清NO和VEGF水平。結論 電針可通過促進內皮祖細胞的增殖、分化，上調血管生長因子NO和VEGF表達，從而促進腦微血管新生，恢復神經功能，提高學習記憶能力。

血管性認知障礙；針灸療法；內皮祖細胞；血管新生；大鼠

血管性認知障礙(VCI)是伴隨著腦血管病的發生出現的一種記憶、認知和行為等障礙的綜合征，其中較為嚴重的又稱血管性癡呆(VD)。近年來，隨著我國老齡人口的不斷增多，血管性癡呆這一問題日益突出。流行病學調查[1]表明:我國VD發病率占老年癡呆癥病例的比例逐年上升，已成為影響我國中老年人健康和生活質量的常見病、多發病。血管性認知障礙發病機制較為復雜，目前尚無特別有效的治療方法,從治療“血管新生(Angiogenesis)”入手是治療缺血性疾病的常用手段之一。大量研究[2-5]提示：針灸對VD具有多環節、多層次、多途徑的調整作用，可以產生清除自由基、改善腦血液循環、調節記憶相關神經遞質、保護腦神經元等作用。國內對針灸影響腦內血管新生的機制研究較少，筆者對血管性認知障礙大鼠腦內血管新生與電針干預機制進行了研究。報道如下。

1 材料

1.1 動物及分組 選擇清潔級成年雄性Wistar大鼠，體質量(200±20)g，購自安徽中醫藥大學實驗動物中心。經1周適應性飼養后,進行學習訓練，篩除訓練過程中反應過于遲鈍或敏感的大鼠。隨機選取12只作為假手術組(假模型組)，其余大鼠制作血管性認知障礙模型，模型制作后第4天用跳臺實驗結合潛伏期成績測試再次篩選合格認知障礙大鼠并保留36只,隨機分為3組，電針實驗組(治療組)、空白對照組(模型對照組)和西藥治療組(茴拉西坦組),每組12只。

1.2 主要儀器與試劑 儀器:G6805-1型電針治療儀(青島華聲儀器廠)；SDQ-30雙極射頻電凝器(上海華誼儀器制造廠)；Morris水迷宮(北京新天地科技公司)；XD-711酶標儀(上海迅達醫療器械公司)；FC-500流式細胞儀為Beckman Coulter公司產品。試劑：NO試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20120519)；VEGF ELISA試劑盒(上海藍基生物科技有限公司，批號Z1ZFBZAA02)；細胞標記物CFS-conjugated-anti-humanVEGFR2/KD由R&D公司提供；PE-conjugated-anti-human CDl33/ACl33由eBioscience公司提供；PC5-conjugated-anti-humanCD34由Beckman Couher公司提供。

2 方法

2.1 血管性癡呆模型復制 參考文獻[3]方法稍加改良制作VD動物模型。方法：大鼠麻醉后俯臥固定于立體定向儀，暴露雙側第一頸椎橫突翼小孔,用直徑0.5 mm的電凝針燒灼雙側翼小孔內的椎動脈，造成永久性閉塞。第2天再將大鼠仰臥固定，小心分離雙側頸總動脈，用微動脈夾夾閉雙側頸總動脈10 min，間隔1 h后再夾閉10 min，共夾閉3次。頸總動脈夾閉2 min內瞳孔不散大者棄之。傷口縫合前局部使用抗生素防止感染。假手術對照組手術過程同VD組大鼠但不熱凝椎動脈、不夾閉頸總動脈。

2.2 干預方法 1)電針實驗組：大鼠固定于鼠板，用特制的大鼠頭部固定器固定大鼠頭部，在大鼠的清醒狀態下，選取百會、大椎、神庭、水溝穴剃毛點記，按照人體穴位的定位方法并參照大鼠骨骼與體形確定穴位。用φ0.3 mm×15 mm毫針沿皮刺進針5 mm或斜刺，百會穴與大椎、神庭與水溝成對分別接G6805電針儀，疏密波，強度以大鼠能耐受為度，通電20 min。1次/d，10次為1療程，共治療3療程，療程之間休息2 d。2)西藥治療組:茴拉西坦0.062 5 g/kg體質量，與蒸餾水混合成0.01 g/mL濃度的溶液，灌胃1次/d，療程與電針實驗組平行。3)空白對照組：與電針實驗組平行，只作鼠板上固定而不作其他任何處理。

2.3 檢測方法

2.3.1 行為學記憶成績測試 電針及西藥治療結束后開始水迷宮檢測。水迷宮內水深41 cm，水溫22～26 ℃。在水池壁標明4個入水點將水池等分為4個象限，隨機選擇一個象限正中放置平臺，沒于水下1 cm，水面覆蓋塑料泡沫。1)定位航行試驗歷時6 d，1次/d。將受試大鼠按順時針方向依次由4個入水點順序面向池壁放入水中，記錄2 min內尋找平臺的時間(即逃避潛伏期)。如果大鼠在2 min內找到平臺，記錄其實際逃避潛伏期;如果在2 min內未找到平臺，由實驗者將其引上平臺并停留10 s，逃避潛伏期記錄為2 min。2)空間探索試驗定位航行試驗結束后撤去平臺，然后任選一相同入水點將大鼠放入水中，測其2 min內跨躍原平臺及其余3個象限相應平臺位置的次數。

2.3.2 流式細胞術檢測外周血EPCs數量 電針實驗組大鼠于每個治療療程結束后1 h，眼眶取血。放于EDTA抗凝管，Ficocl密度離心梯度法收集單個核細胞。分別加入CD34-PC5，CDl33-PE，KDR-FITC3于獲取的單核細胞樣本中，避光孵育30 min。采用流式細胞術檢測單個核細胞懸液，每份標本檢測20萬個細胞，獲得流式細胞散點圖，從中圈出單個核細胞散點區，對所圈的單個核細胞進行分析，計數CD34、CDl33、KDR均為陽性的細胞數量，即內皮祖細胞數量。其余3組取血方法與電針法實驗組相同，時間上與之平行。

2.3.3 血管新生相關因子檢測 電針及西藥治療結束后，各組大鼠眶靜脈取血,常規分離血清,ELISA放射免疫方法檢測VEGF含量；硝酸還原酶法檢測NO。實驗操作步驟嚴格按照說明書進行。

3 結果

3.1 各組水迷宮學習記憶行為學檢測結果 見表1。

表1 各組水迷宮學習記憶行為學檢測結果±s,n=12)

注：與假手術組比較，##P<0.01；與空白對照組比較，△△P<0.01

3.2 各組外周血內皮祖細胞數量檢測結果 見表2。

表2 各組外周血內皮祖細胞數量檢測結果±s,n=12) 個/20萬個細胞

注：與空白對照組比較，#P<0.05，##P<0.01

3.3 各組血清NO/VEGF檢測結果 見表3。

表3 各組血清NO/VEGF檢測結果

注：與假手術組比較，##P<0.01；與空白對照組比較，△△P<0.01

4 討論

血管性癡呆屬于“中風癡呆病”范疇。電針是中醫臨床治療VD的常用方法之一。既往研究發現針灸治療VD，在改善臨床癥狀，降低病死率方面具有肯定的療效。

研究[6-8]顯示，外周血EPCs數量可作為內皮功能和缺血性疾病的獨立危險因素之一,增加外周血或缺血腦組織中的EPCs數量，則有可能促進缺血腦組織的側支循環重建和血管新生，有利于改善缺血腦組織的血液供應，保護神經元，恢復腦組織的功能，從而提高學習記憶能力。NO是眾多血管生長因子的下游介質,來自內皮的NO是誘導血管生成所必需的，具有調節血管生成因子，刺激血管生成的作用，能夠延長內皮細胞生命周期，增強內皮細胞的增殖和遷移力。VEGF被認為是最具影響的血管新生活性物質，在體外可促進內皮細胞增生，在體內可誘導血管新生，在腦缺血后新生血管形成中起主要作用。故血清VEGF、NO含量可以有效反映腦組織中VEGF、NO的合成狀態。

本研究結果顯示，電針能夠改善血管認知障礙大鼠的學習記憶能力，升高外周血血管內皮祖細胞的數量，升高血清NO和VEGF水平。提示電針可能通過促進血管內皮祖細胞的增殖、分化，上調缺血腦組織中血管生長因子NO和VEGF表達，從而促進腦微血管新生，恢復神經功能，提高學習記憶能力。本研究對針灸臨床防治VD提供了理論基礎，但其具體機制尚需進一步深入研究。

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ElectroacupunctureonlearningmemoryandEPCs,NO,VEGFofvasculardementiarats

QIAN ShanJun1,CHEN Xingsheng2*,ZHOU Ting2,CHENG Hongliang2,ZHANG Wendong2,LI Fei2,CAI Ronglin3,WU Shengbing3,CHEN Guoqing3,WANG Chuxu3,HE Junliang3

(1.Anhui Medical College,Hefei 230601,China;2.Second Affiliated Hospital of Anhui University of Traditional Chinese Medicine,Hefei 230061,China;3.Anhui University of Traditional Chinese Medicine,Hefei 230038,China)

ObjectiveTo observe the effect of electroacupuncture on learning memory ability and the changes of EPC,NO,VEGF in plasma of vascular dementia (VD) rats.MethodsAfter induced by 4-vessle occlusion,morris water maze tests were conducted for evaluating the rats learning-memory ability,the contents of EPCs in plasma were measured by flow cytometry,VEGF was determined by ELISA,NO by Nitrate reductase respectively,and compared to aniracetam.ResultsCompared to the control group,electroacupuncture could elevate the learning and memory ability,increased the content of EPCs,NO and VEGF.ConclusionElectroacupuncture can elevate the learning and memory ability by Promoting angiogenesis.

vascular cognitive impairmet;acupuncture;endothelial progenitor cells;angiogenesis;rat

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.05.004

安徽省自然科學基金項目(1208085MH126)。

錢善軍,博士,副教授。研究方向:中醫藥防治老年病。

] 陳幸生，教授，主任醫師，電話：13866703678，電子信箱：chenxs202@126.com。

R285.5

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：2095-6258(2014)05-0770-03

2014-03-19)

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